水稻启动子捕获系统的建立

论文摘要

本实验室构建了两类分别基于T-DNA（GUS）和Ac/Ds（GUS）的捕获质粒。 基于T-DNA（GUS）的质粒p13GUS是将一个无启动子的GUS基因编码区插入T-DNA,并使GUS基因的5’端紧靠T-DNA的右边界,3’端位于T-DNA中部。此质粒经农杆菌介导转化粳稻中花11,得到的转基因植株经组织化学染色检测,共获得31株GUS染色呈阳性的株系。经潮霉素抗性筛选,获得了部分阳性株系的纯合株。 基于Ac/Ds（GUS）的质粒p13B是在载体T-DNA区插入Ds因子的左右边界,将无启动区的GUS基因和无启动区的Ac转座酶基因的3’端相连,并构建在Ds因子的左右边界之间,GUS基因紧靠Ds因子的左边界,Ac转座酶基因紧靠Ds因子的右边界。Ds因子的右边界外接入Ubi基因的启动子,Ds因子的左边界外接入无启动区的抗除草剂Bar基因,Ubi基因的启动子、Bar基因和Ac转座酶基因的方向一致,而与GUS基因方向相反。这一质粒导入水稻植株后Ac转座酶基因在Ubi启动子的指导下表达转座酶,使Ds因子从原位点切离,转座至新的位点,同时Ac转座酶基因由于与启动子分离而不表达,所以保证了Ds转座事件的稳定性。当Ds因子切除后,Ubi启动子与Ds因子左边界外端的Bar基因相连,启动Bar基因表达,这时可用除草剂来筛选Ds转座事件（质粒通过农杆菌介导转化水稻后,T-DNA的插入可用潮霉素来筛选）。 在上述基础上,本文开展了下列几方面的研究: 一、利用绿色荧光蛋白基因（GFP）作为报告基因,构建了基于T-DNA（GFP）的启动子捕获质粒p13EGFP,转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,对所获得的363棵独立转化株系的T0代进行荧光共聚焦显微镜镜检,获得5个GFP呈阳性的株系。将这5个株系繁种一代,经潮霉素筛选获得纯合株系。 二、基于Ac/Ds（GUS）的捕获质粒p13B中引入了Bar基因（抗除草剂基因）,在转基因植株中,当Ds切离后Bar基因即可表达,用除草剂可以方便、快速地筛选Ds发生切离的植株。将此质粒用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了18个独立转化株系。对它们的T2代植株进行了抗除草剂筛选,获得141个抗除草剂转基因植株。PCR分子检测表明,其中37株是Ds因子发生了转座、并可遗传的植株。初步观察到其中5株的GUS染色呈阳性。 三、对质粒p13GUS转化粳稻中花11而获得的8株T2代GUS阳性纯合株,用实时荧光定量PCR方法测定了T-DNA插入的拷贝数,并用反向PCR法分离获得了插入位点的旁邻序列。

论文目录

• 前言
• 第一章 T-DNA（GFP）介导的水稻启动子捕获系统的建立
• 第一节 捕获质粒p13EGFP的构建
• 第二节 水稻幼胚的转化和转基因水稻的获得
• 第三节 TO代转基因植株T-DNA插入情况的PCR检测
• 第四节 TO代转基因植株GFP检测
• 第五节 GFP阳性的转基因T2代纯合株的筛选
• 第六节 p13EGFP阳性株的表型变化
• 小结
• 第二章 Ac／Ds（GUS）介导的水稻启动子捕获系统的建立
• 第一节 捕获质粒p13B的结构
• 第二节 转基因水稻T2代Basta抗性植株的筛选
• 第三节 Basta抗性植株中Ds切离的转座分析
• 第四节 Ds因子已转座的T2代植株GUS染色分析
• 小结
• 第三章 T-DNA（GUS）介导的启动子捕获系统中GUS阳性株拷贝数和旁邻序列的分析
• 第一节 p13GUS阳性株拷贝数的测定
• 第二节 p13GUS阳性株T-DNA插入位点旁邻序列的分析
• 小结
• 第四章 材料与方法
• 第一节 材料
• 第二节 方法
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢