群体微囊藻XW01细胞表面蛋白性质的研究

论文摘要

在我国以微囊藻为主要优势类群的蓝藻水华问题日益突出,严重危害了生态环境和人类健康。群体集聚状态是微囊藻获得生态优势的关键,研究微囊藻水华及群体集聚的分子机制对于解决蓝藻水华问题具有一定的指导意义。目前对形成微囊藻群体的机制,特别是细胞间的相互作用机制所知甚少,本文比较研究了群体及分散状态的铜绿微囊藻细胞表层蛋白的特点,以期发现表层蛋白对于群体的形成及维持的作用。首先运用透射电子显微镜观察两株铜绿微囊藻Microcystis aeruginosaXW01（群体状态）及M. aeruginosa PCC7806（单细胞状态）细胞外部的结构。经过分析发现,XW01的细胞壁表层覆盖着规则排列的六边形蛋白晶体（HexagonalP6）,而在PCC7806上没有明显的晶体结构层存在。采用LiCl法提取这两株藻的表层蛋白,经SDS-PAGE电泳后发现,从XW01中提取到了分子量约为70 KDa的表层蛋白,而在PCC7806中却无法提取到该蛋白。经ESI-TRAP离子阱质谱鉴定,发现该蛋白与PCC7806的一个未知功能蛋白有高度同源性,在GenBank中的编号为CA089090.1,该基因编码的是一种新的细胞表面蛋白。运用Expasy网站的蛋白分析工具TMHMM进行跨膜特性的预测,结果显示CA089090.1为膜外蛋白。上述结果提示：细胞表层蛋白在群体集聚中起重要作用。为进一步弄清表层蛋白的作用,从基因表达层面进行了初步研究。通过NCBI数据库的比对,找出基因CA089090.1在蓝藻中保守性较高的区域,设计了特异性PCR引物,并在XW01中扩增出一段长度为689bp的中间片段,该片段与CA089090.1相应部分的同源性为95%；进而运用一种高效的染色体步移法TAIL-PCR逐步扩增获得该基因1002bp的序列片段,为该基因的进一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 微囊藻群体集聚有利于获得生态优势
• 1.2 关于微囊藻群体集聚的细胞学研究
• 1.3 关于S-layers的研究
• 1.3.1 晶体形态与结构特征
• 1.3.2 S-layers的理化性质
• 1.3.3 S-layers基因的特征
• 1.3.4 研究S-layers的方法
• 1.3.5 S-layers的功能研究进展
• 1.4 研究方案及技术路线
• 1.4.1 总体研究方案
• 1.4.2 拟采用的技术路线
• 第2章 微囊藻S-layers蛋白的性质及其与群体集聚的关系研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验藻种
• 2.1.2 酶及化学试剂
• 2.1.3 引物及DNA测序
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微囊藻细胞壁的制备
• 2.2.2 细胞壁的透射电镜观察
• 2.2.3 S-layers的LiCl提取法
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳检测
• 2.2.5 电泳洗脱法回收S-layers蛋白
• 2.2.6 质谱分析
• 2.2.7 微囊藻基因组DNA的提取
• 2.2.8 在微囊藻XW01中扩增获得基因CAO890090.1的中间序列
• 2.2.9 TAIL-PCR扩增获得微囊藻XW01的S-layer基因全序列
• 2.2.10 微囊藻总RNA提取
• 2.2.11 去除总RNA中的基因组DNA
• 2.2.12 反转录RT-PCR
• 2.2.13 感受态大肠杆菌的制备与转化
• 2.2.14 质粒提取与鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 微囊藻细胞壁S-layer晶体的电镜观察
• 2.3.2 寻找XW01的S-layer表达基因
• 2.3.3 S-layers的提取纯化
• 2.3.4 获得XW01的S-layers基因部分片段
• 2.3.5 基因敲除工作的初步研究
• 2.4 讨论
• 2.4.1 从XW01中分离出的S-layer基因与PCC7806的CA089090.1是同源基因
• 2.4.2 S-layers与微囊藻群体集聚密切相关
• 2.5 本文结论
• 参考文献
• 附录 浮游植物叶绿素a提取方法的比较研究
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢