端粒酶hTERT基因反义RNA表达载体的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721的作用

论文摘要

端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质结构,具有维持染色体的结构稳定和生物功能的作用.。随着细胞分裂端粒每次缩短30～200 bp,当端粒缩短到某临界长度时,细胞则发生衰老或凋亡。而许多肿瘤细胞由于某种机制的作用,激活了端粒酶从而使端粒维持在一定长度,使癌细胞能够持续繁殖。端粒酶是一种核糖蛋白酶,端粒酶催化亚基具有逆转录酶活性,能以自身RNA 为模板,向染色体末端添加端粒序列,弥补端粒的丢失阻止端粒缩短。据统计,大部分恶化肿瘤中端粒酶检测为阳性,由于端粒酶活性和肿瘤细胞的生存与转化间存在如此高的相关性,人们认为两者之间必然有某种联系,端粒酶激活可能是细胞癌变或永生化的一个必然通路,因此抑制端粒酶活性可作为肿瘤基因治疗的一个理想的新靶点。本文以分子克隆技术成功构建人端粒逆转录酶（hTERT）基因反义RNA 表达载体,研究其对肝癌细胞SMMC-7721 生长的影响。采用聚合酶链反应（PCR）扩增hTERT基因片段,经测序证实后,反向插入到表达载体pcDNA3.1/myc-His 中,成功构建hTERT 基因反义表达载体pcDNA3.1-hTERT（as）,经脂质体介导转染人肝癌细胞株SMMC-7721,通过新霉素类似物（G418）筛选获得表达端粒酶hTERT 基因反义RNA 的稳定细胞株。采用噻唑蓝（MTT）法、端粒重复序列扩增-酶连免疫吸附检测法（TRAP-ELISA）、流式细胞术和荧光定量PCR 仪分别观察细胞的增殖、端粒酶的活性和细胞凋亡及细胞hTERT 基因mRNA 的水平,结果发现: 1. 通过细胞生长曲线的绘制和MTT 法研究端粒酶hTERT 基因反义RNA 对肝癌细胞SMMC-7721 生长的影响。结果表明,与对照组细胞相比,hTERT基因反义RNA 能明显抑制肝癌细胞生长。2. 通过TRAP-ELISA 法研究端粒酶hTERT 基因反义RNA 对肝癌细胞端粒酶活性的影响。hTERT 反义RNA 转入肝癌细胞SMMC-7721 后,与对照组相比,细胞端粒酶活性明显降低。3. 通过流式细胞仪研究端粒酶hTERT 基因反义RNA 对肝癌细胞的凋亡和细

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 端粒结构与功能
• 1.3 端粒酶结构与功能
• 1.4 端粒、端粒酶与肿瘤
• 1.5 反义核酸技术与肿瘤治疗
• 1.6 反义核酸技术在肿瘤治疗应用中存在的问题和未来发展方向
• 1.7 本文的研究目的与内容
• 2 端粒酶hTERT 基因反义RNA 表达载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 端粒酶hTERT 基因反义RNA 对人肝癌细胞SMMC-7721 的作用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 全文总结
• 4.1 本文的主要研究结果
• 4.2 本文的创新之处
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2 pGEM-T/hTERT 测序结果
• 附录3 主要缩写词表