Hg诱导和SA调节苜蓿氧化胁迫反应及miRNAs的分离、鉴定及表达分析

论文摘要

汞已经成为农田有毒重金属污染的主要来源之一,它在植物中积累会破坏细胞功能,影响植物生长和发育。为了了解汞对植物的毒害作用,我们用1-40μMHgCl2或用20μM HgCl2连续处理紫花苜蓿,研究汞诱导氧化胁迫的机制。组织染色表明在汞胁迫下,紫花苜蓿根的分生区和伸长区均发生明显的膜脂过氧化作用,且膜的完整性受到破坏。根和叶中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）含量的变化证实了这一点。用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测脂氧合酶,发现在紫花苜蓿根和叶中分别有两个和三个同工酶,在汞胁迫下变化不尽相同。随着汞浓度的上升,叶片中02-含量及叶和根中H202含量上升,NADH氧化酶的活性上升。为了研究汞胁迫下的生化反应,我们检测了紫花苜蓿中抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化物酶（POD）,过氧化氢酶（CAT）,抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性。经汞处理后,紫花苜蓿叶中SOD, POD, APX, GR和CAT总活性上升,根中SOD和POD活性也是上升的。高浓度的汞（40μM）激活根中APX活性,而10-20μM HgCl2抑制了GR活性。活性PAGE分析表明在叶和根中分别检测到了5和3种SOD同工酶,7和10种POD同工酶,8和4种APX同工酶,但汞胁迫下变化不同。仅在叶片中检测到一种CAT带。我们也检测了抗氧化剂如抗坏血酸（ASC）和谷胱甘肽（GSH）的含量,结果表明汞胁迫下,ASC和GSH在根中含量下降,在叶片中积累。我们的研究表明汞胁迫下紫花苜蓿中02-和H202含量上升和抗氧化酶及抗氧化剂含量的变化相关,这些结果不但可以作为土壤受汞污染的生化指示剂,而且可以为研究植物耐汞机制提供重要的理论依据。水杨酸（SA）作为信号分子介导许多生物和非生物胁迫诱导的生理反应。我们研究了SA在调节汞诱导的紫花苜蓿根部氧化胁迫中的作用。用0.2mM SA预处理12h再用10μM Hg2+处理24h后发现,SA能缓解汞对根的毒害,具体表现为降低了根的脂质过氧化产物,促进汞胁迫下根的生长。组织染色进一步证明SA缓解了汞对膜完整性的破坏。SA预处理提高了汞胁迫下的NADH氧化酶,APX和POD的活性,但SOD的活性稍有降低。我们检测了ASC, GSH和脯氨酸含量,发现经SA预处理再用汞处理比仅用汞处理的紫花苜蓿根中积累了更多的ASC, GSH和脯氨酸。所有这些结果表明SA在保护植物抵御汞诱导的氧化胁迫中发挥着重要的作用。microRNAs （miRNAs）是植物和动物中一类调控基因转录后表达的短链、非编码的小分子RNAs （small RNA, sRNA）.迄今为止,人们通过生物信息学和实验方法分离和鉴定到了大量的miRNAs,并登录在miRNAs数据库中（http://www.sanger.ac.uk/）。我们用生物信息学的方法从蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的ESTs和GSS中预测到了新的miRNAs及它们的靶基因。将拟南芥,水稻及其它植物中已知的miRNAs与蒺藜苜蓿ESTs和GSS数据库进行比对的同时,设置一系列严格的筛选标准,分析候选miRNAs序列特征,包括二级结构、茎环长度和miRNAs的保守性,最终筛选出了38个miRNAs.去除已登录的12个,我们在蒺藜苜蓿中一共发现了26个新的miRNAs,它们共代表15个家族。进一步将新鉴定的miRNAs和蒺藜苜蓿mRNA数据库进行比对,预测到了16个靶基因。分析表明上述大多数靶基因编码的产物为转录因子及重要代谢酶类,控制着植物生长发育,信号转导及各种胁迫反应。为了验证预测的正确性,我们用RT-PCR的方法,在蒺藜苜蓿根、茎、叶和花中验证到8个miRNAs,并分析了这些miRNAs在受汞胁迫的叶片中的表达谱。尽管用生物信息学的方法可以分离和鉴定出很多miRNAs,但是其它非保守的miRNAs只有通过直接克隆法才能分离得到。为了获得新的响应胁迫的miRNAs,我们构建了一个经20μM HgCl2处理的蒺藜苜蓿sRNA文库,结果在蒺藜苜蓿中一共克隆到10个新的miRNAs,其中5个为植物中保守序列（1个在上述的生物信息学方法已经预测到）,另外5个miRNAs在其它物种中还没有发现,这些miRNAs的生理功能有待于做进一步的鉴定。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1 汞对植物的毒害作用
• 1.1 汞的存在形式及在植物中的吸收与转运
• 1.2 植物对Hg毒害的反应
• 1.2.1 光合作用
• 1.2.2 细胞膜透性
• 1.2.3 相关基因和（酶）蛋白的反应
• 1.2.4 植物螯合素
• 1.2.5 氧化胁迫反应
• 2 水杨酸与胁迫响应
• 2.1 植物中水杨酸对胁迫的调节作用
• 2.2 植物中水杨酸调节胁迫的机理
• 2.2.1 ROS可能介导了SA调节胁迫的过程
• 2+信使系统有关'>2.2.2 与Ca²⁺信使系统有关
• 2.2.3 与蛋白质的磷酸化与去磷酸化反应有关
• 3 microRNAs
• 3.1 microRNAs的生物合成
• 3.2 microRNAs作用靶基因的机制
• 3.3 miRNA、siRNA和piRNA的关系
• 3.4 miRNAs研究的技术和方法
• 3.5 miRNAs生物功能
• 3.5.1 miRNAs与植物生长发育
• 3.5.2 miRNAs与逆境胁迫
• 4 本研究的目的和意义
• 第一章 紫花苜蓿根中汞诱导的氧化胁迫及响应机制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养与处理
• 1.2 生理指标测定
• 1.3 生理反应组织染色
• 1.4 酶活性测定
• 1.5 同工酶电泳
• 1.6 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 汞对紫花苜蓿根生长和脂质过氧化的影响
• 2O₂水平和NADH氧化酶活性的影响'>2.2 汞对紫花苜蓿根中H₂O₂水平和NADH氧化酶活性的影响
• 2.3 汞对紫花苜蓿根中抗氧化酶活性的影响
• 2.4 汞对紫花苜蓿根中抗氧化物含量的影响
• 3 讨论
• 第二章 紫花苜蓿叶片中汞诱导的氧化胁迫及响应机制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养与处理
• 1.2 生理指标测定
• 1.3 生理反应组织染色
• 1.4 酶活性的测定
• 1.5 同工酶电泳
• 1.6 统计分析
• 2 结果与分析
• 2^-,H₂O₂水平和NADH氧化酶活性的影响'>2.1 汞对紫花苜蓿叶中O₂^-,H₂O₂水平和NADH氧化酶活性的影响
• 2.2 汞对紫花苜蓿叶中脂质过氧化的影响
• 2.3 汞对紫花苜蓿叶中抗氧化酶活性的影响
• 2.4 汞对紫花苜蓿叶中ASC和GSH含量的影响
• 3 讨论
• 第三章 外源SA缓解紫花苜蓿根中汞诱导的氧化胁迫
• 1 材料与方法
• 1.1 实验培养与处理
• 1.2 生理指标测定
• 1.3 生理反应组织染色
• 1.4 酶活性的测定
• 1.5 同工酶电泳
• 1.6 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 SA对紫花苜蓿根中汞诱导的氧化胁迫的影响
• 2.2 SA对紫花苜蓿在汞胁迫下根中抗氧化酶活性的影响
• 2.3 SA对紫花苜蓿在汞胁迫下根中抗氧化剂含量的影响
• 3 讨论
• 第四章 蒺藜苜蓿miRNAs及其靶基因的生物信息学预测和验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养与处理
• 1.2 生物信息学方法
• 1.2.1 相关数据库
• 1.2.2 应用软件
• 1.2.3 蒺藜苜蓿miRNAs的预测
• 1.2.4 蒺藜苜蓿miRNAs靶基因预测
• 1.3 分子生物学方法验证miRAs
• 1.3.1 试剂与试剂盒
• 1.3.2 miRNAs克隆
• 1.3.2.1 总RNA提取与质量检测
• 1.3.2.2 RNA 3'末端加ploy（A）
• 1.3.2.3 cDNA合成及miRNAs扩增
• 1.3.2.4 miRNAs目的片段回收
• 1.3.2.5 目的片段与载体连接
• 1.3.2.6 目的片段转化及鉴定
• 2 结果与讨论
• 2.1 蒺藜苜蓿miRNAs的预测
• 2.1.1 蒺藜苜蓿miRNAs的筛选依据
• 2.1.2 蒺藜苜蓿miRNAs的多样性
• 2.2 蒺藜苜蓿miRNAs靶基因的预测和主要功能分析
• 2.3 蒺藜苜蓿miRNAs的实验验证和表达
• 2.3.1 实验验证
• 2.3.2 miRNAs表达结果与分析
• 第五章 蒺藜苜蓿miRNAs的分子克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养与处理
• 1.2 直接克隆法分离和鉴定miRNAs
• 1.2.1 试剂与试剂盒
• 1.2.2 miRNAs克隆
• 1.2.2.1 总RNA提取
• 1.2.2.2 小片段RNA的纯化和回收
• 1.2.2.3 小RNA克隆
• 1.2.2.4 目的片段与载体连接及转化
• 1.2.2.5 目的片段鉴定
• 1.3 生物信息学分析miRNAs
• 1.3.1 相关数据库
• 1.3.2 应用软件
• 1.3.3 miRNAs鉴定
• 2 结果与讨论
• 3 工作展望
• 全文小结
• 创新点
• 存在问题及工作展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢