丹毒丝菌的分离鉴定及其SpaA-N蛋白和lipo蛋白的免疫原性分析

论文摘要

本实验室从湖南省内送检的11份疑似丹毒丝菌感染猪病料中共分离到4株细菌,并对其作了如下工作。一、对4株细菌进行细菌学试验,证明均符合丹毒丝菌的培养和生化特性。根据GenBank中猪丹毒丝菌的16SrRNA基因序列的差异设计特异性引物,4株临床分离的丹毒丝菌菌进行PCR扩增。结果显示,此引物对4株丹毒丝菌均扩增出与预期大小471 bp相一致的片段,而对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌等10种病原体的扩增结果均为阴性；PCR敏感性试验结果表明,本方法可以检测到186CFU、24.5pg的丹毒丝菌,并可以利用临床病料直接进行检测,节省了检测时间和劳动力,能够适用于日常实验室的检测。二、测定了丹毒丝菌24h生长曲线。根据该曲线取处于生长对数末期的丹毒丝菌分对昆明小鼠皮下接种104、103、102、10CFU,剂量仅102CFU就可以使小鼠完全死亡,并可从死亡小鼠的心、肝、脾、肺、肾中分离到该细菌,表明湖南分离株丹毒丝菌对昆明小鼠具有非常高的致病性。根据GenBank上已发表的丹毒丝菌毒力基因序列设计引物,以4株野毒株为模板扩增出丹毒丝菌的透明质酸酶；荚膜多糖A、B、C三种；溶血素A、B两种和SpaA共七种毒力基因,并通过测序分析湖南株的同源性、碱基变异情况。三、根据丹毒丝菌脂蛋白的基因鸟枪序列NZ-ACLK1000024、NZACLK01000029、NZ-ACLKO1000004和丹毒丝菌spa蛋白基因序列AB259652、AB07447等设计特异性引物,以10HUN2株DNA为模板,通过PCR扩增出Bmp、lipo29、lipo4和SpaA基因N端4种蛋白的片段,并在原核表达载体pET-28a（+）中对4种蛋白片段进行表达,经纯化后将4种蛋白在第0天、14天、28天对小鼠各皮下免疫一次,在小鼠末次免疫结束一周后分别对免疫组和对照组小鼠攻毒,攻毒量至少10倍最少致死量（1000CFU）,并观察各组小鼠的攻毒结果。昆明小鼠的免疫试验表明spa-N和Bmp重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 丹毒丝菌毒力因子的研究进展
• 2 选题的目的与意义
• 第二章 丹毒丝菌的分离鉴定及其毒力因子的测定和对小鼠的致病性实验
• 1 材料与方法
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 丹毒丝菌表面蛋白SpaA-N、lipo4、lipo29、Bmp基因的克隆表达及表达产物的免疫原性分析
• 1 材料与主要试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历