草莓镶脉病毒（SVBV）启动子的鉴定

论文摘要

启动子是基因表达调控的重要元件，它能够启动下游基因的转录。本研究克隆了中国草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）全长启动子以及该启动子的缺失突变体。构建系列启动子植物表达载体，利用gus与gfp两种报告基因鉴定了SVBV启动子的驱动强度和表达类型。结果表明，SVBV全长启动子的驱动活性高于对照花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）35S启动子。本研究鉴定了一个新的植物病毒启动子，将为植物基因工程提供一种新的工具。1. SVBV全长启动子及其缺失突变体的克隆与植物表达载体的构建设计特异性引物分别扩增SVBV全长启动子及其2个缺失突变体序列，克隆并测序，SVBV全长启动子（SVBV P1）序列长度为984bp，2个缺失突变体为核心启动子（SVBV P2）和缺失上游调控区启动子（SVBV P3），长度为324bp和819bp。将SVBV P1、SVBV P2和SVBV P3分别与pINT121载体gus基因前的35S启动子置换，获得植物表达载体pINT P1、pINT P2和pINT P3。再将SVBV P1和美国SVBV全长启动子分别与pCHF3载体gfp基因前的35S启动子置换，获得植物表达载体pCHF P1和pCHF P5。2.植物表达载体以根癌土壤杆菌介导进行瞬间表达将启动子系列表达载体pINT P1、pINT P2、pINT P3、pINT P4、pINT P5和pINT121电击导入根癌土壤杆菌，菌液注射本氏烟茎部，组织化学染色进行启动子活性的定性鉴定；同样将表达载体pCHF P1、pCHF P5和pCHF3分别电击导入根癌土壤杆菌，菌液注射本氏烟茎部，通过荧光显微镜观察鉴定各启动子的活性。再用根癌土壤杆菌菌液浸润本氏烟叶片，利用gus荧光光度测定法进行启动子活性的定量分析，鉴定不同启动子活性强弱。3.瞬间表达中gus活性的组织化学检测和gfp荧光活性观察利用组织化学染色法鉴定启动子的活性，染色结果表明，在pINT P1、pINTP2、pINT P3、pINT P4、pINT P5和pINT121表达的植株茎部的维管组织和部分皮层细胞均能观察到蓝色位点，说明各启动子都能驱动gus基因在植物细胞中表达。从各切片的gus染色强度上来看，pINT P1的启动子驱动gus基因的表达水平要高于阳性对照pINT121的35S启动子。利用荧光显微镜观察启动子的活性，荧光观察表明，在pCHF P1和pCHF P5和pCHF3表达的植株维管组织均能观察到绿色荧光，说明各启动子均能驱动gfp基因在植物细胞中表达。从各切片的gfp荧光强度上来看，pCHF P1中gfp基因的表达水平要高于阳性对照pCHF3。用根癌土壤杆菌菌液注射本氏烟的植株作为阴性对照，茎杆切片中几乎观察不到绿色荧光。4.瞬间表达中gus荧光活性分析荧光光度法测定结果表明，pINT P1的平均相对gus活性最高，达pINT121的280%。pINT P2、pINT P3、pINT P4、pINT P5的gus活性分别为pINT121的29%、87%、125%和162%，与pINT P1差异显著（P<0.05）。以根癌土壤杆菌菌液浸润本氏烟叶片作为空白对照，几乎没有gus表达活性。5.转基因普通烟gus活性的组织化学检测转基因普通烟幼苗的gus组织化学染色分析表明，pINT P1、pINT P5和pINT121转基因植株的叶片蓝色最深，而茎杆和根部蓝色相对较浅，说明SVBV启动子和CaMV35S启动子驱动gus基因均在叶片组织中表达强度最高。茎横切面组织化学染色表明，pINT P1转基因烟草的茎横切面蓝色比对照pINT121深，说明中国SVBV启动子驱动gus基因稳定表达的活性高于CaMV35S启动子。另外，SVBV启动子与CaMV35S启动子一样，不仅能够驱动gus基因在烟草的根、茎、叶各个部位表达，而且在茎杆的表皮细胞、薄壁细胞、皮层细胞、维管和髓部细胞均能表达。因此，可将SVBV启动子鉴定为一个组成型表达启动子。6.转基因普通烟的gus荧光活性分析及gus mRNA的半定量RT-PCR检测荧光光度法测定结果表明，pINT P1启动子的平均相对gus活性最高，并且pINT P1和pINT P5的驱动活性都高于pINT121。这从翻译水平上，验证了SVBV启动子驱动gus基因的表达活性高于CaMV35S启动子。提取稳定表达的转基因普通烟总RNA，半定量RT-PCR分析表明，相同循环数下，pINT P1和pINT121内参β-actin基因条带亮度基本相同，而pINT P1的gus基因条带亮度明显高于pINT121。这说明pINT P1转基因植物中gus基因转录的mRNA积累量显著高于pINT121，也验证了中国SVBV启动子驱动gus基因的转录水平显著高于CaMV35S启动子。

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文献综述

1 启动子概述

2 植物启动子的研究进展

2.1 高等植物启动子的结构

2.1.1 转录起始位点

2.1.2 TATA-box

2.1.3 一般上游启动子元件

2.1.3.1 CAAT-box

2.1.3.2 GC-box

2.1.3.3 抑制子和增强子

2.2 高等植物启动子的分类

2.2.1 组成型启动子

2.2.1.1 CaMV 35S启动子

2.2.1.2 泛素Ubiquitin启动子

2.2.1.3 NOS、OCS启动子

2.2.2 组织或器官特异性启动子

2.2.2.1 营养器官特异性启动子

2.2.2.2 生殖器官特异性表达启动子

2.2.3 诱导型启动子

2.2.3.1 光诱导型启动子

2.2.3.2 伤诱导型启动子

2.2.3.3 植物激素诱导型启动子

2.2.3.4 温度诱导型启动子

3 植物病毒启动子研究概况

3.1 双生病毒启动子

3.2 矮缩病毒启动子

3.3 杆状DNA病毒属启动子

3.4 蔷薇科植物病毒启动子

引言

材料与方法

1 供试材料

1.1 病样来源

1.2 植物材料

1.3 菌种和载体

1.4 酶和化学试剂

1.5 常用缓冲溶液和培养基

1.6 抗生素

1.7 仪器设备

2 试验方法

2.1 叶片总DNA的提取

2.2 PCR技术

2.3 PCR产物的克隆

2.3.1 PCR产物回收和纯化

2.3.2 PCR产物的连接

2.3.3 感受态细胞的制备

2.3.4 连接产物的转化

2.3.5 阳性克隆的PCR鉴定

2.3.6 质粒提取

2.4 克隆基因的测序和分析

2.5 SVBV启动子的克隆

2.5.1 启动子的引物设计

2.5.2 启动子的PCR扩增

2.6 启动子的序列分析

2.6.1 启动子序列相似性分析

2.7 启动子的缺失构建

2.8 植物表达载体的构建

2.8.1 植物表达载体的构建策略

2.8.2 植物表达载体的构建过程

2.9 电击转化农杆菌

2.9.1 电击转化感受态细胞制备

2.9.2 表达载体转化农杆菌

2.10 瞬间表达

2.11 gus活性分析

2.11.1 gus活性的组织化学分析

2.11.2 蛋白活性的荧光光度测定

2.11.3 蛋白质含量测定

2.11.4 gus荧光活性分析

2.12 gfp绿色荧光检测

2.13 转基因烟草的半定量RT-PCR检测

2.13.1 叶片总RNA的提取

2.13.2 cDNA第一条链的合成

2.13.3 半定量RT-PCR反应

2.14 转基因烟草植株的gus组织化学染色

2.15 转基因烟草植株的gus荧光活性分析

结果与分析

1 SVBV启动子的克隆

1.1 全长启动子的克隆

1.2 核心区启动子的克隆

1.3 缺失上游区启动子的克隆

2 植物表达载体的构建

2.1 SVBV启动子驱动gus基因表达载体的构建

2.2 SVBV启动子驱动gfp基因表达载体的构建

3 瞬间表达的组织化学检测

3.1 瞬间表达中gus的组织化学染色

3.2 瞬间表达中gfp活性的检测

4 瞬间表达中gus荧光活性分析

5 转基因烟草的gus组织化学染色

6 转基因烟草的gus荧光活性分析及半定量RT-PCR检测

6.1 转基因烟草的gus荧光活性分析

6.2 转基因烟草中gus的半定量PCR检测

讨论

1 瞬间表达中SVBV启动子的活性分析

2 转基因烟草的启动子活性分析

结论

参考文献

附录A：常用缓冲液及培养基配方法

附录B：常用的抗生素和激素及使用浓度

附录C：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器

附录D：本文所用的重要缩写词及中文对照

致谢

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