论文摘要
Prohibitin（PHB）是一种在进化上高度保守的蛋白质,因其具有明显的抗细胞增殖作用而得名,广泛分布于哺乳类、植物、细菌等多种生物体中。PHB蛋白不仅是一类新型的分子伴侣蛋白,在维持线粒体结构和功能方面具有重要作用,而且具有转录调控作用,在细胞增殖、凋亡等多种生命活动中发挥重要作用,但到目前为止PHB蛋白行使其功能的具体的分子机制尚不完全清楚。通过筛选家蚕蛹cDNA文库获得一条cDNA序列,全长为1145 bp,开放阅读框（ORF）大小为825 bp,编码274个氨基酸残基,预测分子量大小为30.08 kD,等电点为6.79。生物信息学分析发现该基因编码的氨基酸序列与其他物种中的Prohibitin蛋白氨基酸序列同源性较高,并且都含有Band7prohibitin这一特征的保守结构域,故将其命名为Bmphb基因（Bombyx mori prohibitin, Bmphb）,GenBank登陆号为DQ311431。将Bmphb基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果显示该cDNA序列具有3个内含子,4个外显子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。根据Bmphb基因ORF设计上下游引物,PCR扩增目的基因,经BamH I和Xho I双酶切后,插入到原核表达载体pET-28a（+）的相应酶切位点上,成功构建了重组融合蛋白表达质粒pET-28a（+）-Bmphb,经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序分析证实该重组质粒的正确性。将该重组质粒pET-28a（+）-Bmphb转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,筛选阳性克隆,以终浓度为1 mM的IPTG诱导工程菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,SDS-PAGE实验结果显示在35 kD左右的位置有一条浓集的特异性蛋白条带,与预期值（融合标签3.56 kD,BmPHB 30.08 kD）相符。重组融合蛋白His-BmPHB以包涵体的形式存在,包涵体经洗涤、溶解后,用镍柱亲和层析纯化,再用FPLC反相柱层析进一步纯化后,经质谱分析得到该重组融合蛋白的分子量为33.53 kD,与理论值相符,证实了该融合蛋白表达的正确性。以纯化所得蛋白His-BmPHB为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体。多克隆抗体经Protein A凝胶柱纯化,ELISA检测抗血清的效价可达到1:12800以上。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,亚细胞定位结果表明,Bm5细胞中BmPHB蛋白在细胞核和细胞质中均有分布且主要存在于细胞质中。提取家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织总蛋白,Western blotting实验结果表明,BmPHB蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹三个发育时期都有表达,在五龄幼虫的生殖腺、马氏管、气管、脂肪体、肠、头等组织中都有表达,且表达量依次降低,而在丝腺、表皮组织中以及蛾期没有检测到该蛋白的存在。我们推测BmPHB可能在家蚕的生长发育中发挥重要的作用。目前为止未见家蚕Prohibitin蛋白的相关研究报道,故本研究为深入研究BmPHB蛋白的功能奠定了基础。