黄芪多糖促进刺参免疫力和生长性能的研究

论文摘要

刺参养殖过程中,抗生素的滥用严重危害人类的健康并导致新的致病菌产生,多糖类免疫增强剂能通过激发机体自身免疫功能,从而增强对病原微生物的抵抗力,且副作用小,是一种具有广阔前景的抗生素替代品。黄芪多糖（APS）是多糖类免疫增强剂中机理研究较为深入的植物型天然多糖,它能作用于机体的多靶点而提高非特异性免疫力,同时增殖动物肠道中有益菌,从而促进生长和提高肠道天然屏障功能,因此已得到广泛应用,但对刺参免疫力和生长的影响目前尚无相关报道。本文选用一龄以上刺参为实验对象,采用体内和体外实验,从分子水平、细胞水平和整体水平研究了APS对刺参免疫力和生长性能的影响,具体实验内容与结果如下:从刺参体腔细胞中克隆出长度为410bp的β-actin基因部分片段（bankit1091302）,采用所克隆β-actin基因部分片段作为内参,利用半定量PCR法考察APS对溶菌酶mRNA表达量的影响。研究发现APS能够剂量依赖性的提高体细胞中i型溶菌酶mRNA表达量,其中5mg/kg剂量组提高达显著水平,当APS剂量为20mg/kg时,基本无效。采用刺参吞噬细胞作为模型,体外实验研究APS在18℃,22℃和25℃时对细胞吞噬活性和超氧阴离子（O2-）产量的影响。吞噬活性的测定采用显微镜计数法直接观察刺参体腔吞噬阿米巴细胞对酵母细胞的吞噬率和吞噬指数,O2-产量测定利用NBT还原法。结果表明,当环境温度由18℃上升至25℃时,刺参细胞免疫功能随之下降,而APS能够有效提高体腔细胞的吞噬活性和O2-产量。在18和22℃时,20μg/ml的APS能够显著提高细胞吞噬率和吞噬指数。同时,刺参体细胞经诱导后产生O2-,20μg/ml的APS能显著提高各温度梯度下NBT阳性细胞数。当APS浓度提高到40μg/m时,吞噬活性和O2-产量均呈现出下降趋势。体外实验研究证实,APS对刺参的免疫促进作用呈剂量依赖性,剂量过高会产生免疫抑制。为了进一步研究APS在刺参养殖中的可行性,将APS添加到饲料中,对刺参进行养殖实验,同时用不同工艺处理的黄芪（黄芪粗粉、黄芪超微粉、黄芪化微粉）为参比考察其对刺参不同免疫指标的影响,以阐明提高抗病力的机理。通过对免疫相关指标检测结果表明,在实验的第20d,黄芪化微粉和APS组细胞吞噬率、O2-产量和酸性磷酸酶活力显著增加,APS组溶菌酶活力和凝集素效价显著提高,黄芪粗粉和黄芪超微粉均能显著提高血清酸性磷酸酶活力。经过40d养殖,黄芪化微粉显著提高溶菌酶和酸性磷酸酶活力,APS组细胞吞噬率、溶菌酶、碱性磷酸酶活力和凝集素效价均显著提高;在实验的第60d,黄芪化微粉组溶菌酶活力和凝集素效价显著提高,黄芪粗粉、超微粉和化微粉组溶菌酶活力和酸性磷酸酶活力均显著提高,APS组凝集素效价显著提高。经过60d养殖实验后,采用灿烂弧菌对各组刺参进行浸泡攻毒试验,黄芪化微粉和APS组的患病率显著低于对照组,仅为16.67%和25.0%（对照组为66.67%）。免疫增强剂在促进机体免疫力的同时,有时会对动物生长产生一定的抑制。因此,在考察免疫力指标同时,对刺参生长性能也进行研究。结果证实,黄芪化微粉和APS对刺参特殊生长率（SGR）有提高作用,与对照组相比,分别提高30.03%和20.94%,两组在有效降低脏壁比中也具有一定作用,但对体壁中一般营养成分（除APS组灰分含量显著高于对照组）无明显影响。在考察消化酶活性研究中发现,各实验组（除黄芪粗粉组）在实验进行到第40d和第60d时都显著提高蛋白酶活力;在40d,除了黄芪超微粉组,各组均显著提高淀粉酶活力;黄芪超微粉和APS则能够在第40d和60d显著提高褐藻酸酶活力。本文采用体内和体外实验,研究APS对刺参肠道中产褐藻酸酶菌菌群数量的影响。研究表明,饲喂APS后,刺参肠壁中产褐藻酸酶菌在总异养菌中所占的比值约为其它各组的2倍,而在肠道泥样中的比例较其它组高出1～2个数量级,极显著高于对照组（P＜0.01）。体外实验表明,APS能显著提高产褐藻酸酶菌的生物量和产酶活力,且随着APS浓度的增加,酶活力和生物量呈先上升后下降的趋势,其中0.1%剂量组酶活力和生物量显著高于0.05%和2.0%两个梯度组。综上所述,APS能够通过作用于刺参的体液免疫和细胞免疫提高机体的免疫力,进而增强对病原菌的抵抗力,并且能够提高肠道消化酶活力和肠道中产褐藻酸酶菌产酶能力,从而对生长具有一定的促进作用。本文对APS发挥免疫和生长促进作用的机理进行初步研究,为其作为免疫增强剂用于刺参养殖奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1.文献综述
• 1.1 棘皮动物免疫防御机制
• 1.1.1 体壁组织的抗菌活性
• 1.1.2 细胞免疫防御
• 1.1.3 体液免疫防御
• 1.2 海参消化生理学和肠道菌群的研究
• 1.2.1 海参消化生理研究现状
• 1.2.2 海参肠道菌群的研究
• 1.3 多糖类免疫增强剂及其在水产动物中的应用
• 1.3.1 免疫增强剂
• 1.3.2 多糖类免疫增强剂在水产动物中的应用现状
• 1.4 黄芪多糖（APS）免疫调节作用的研究进展
• 1.4.1 中药黄芪及其化学成分
• 1.4.2 APS的化学成分
• 1.4.3 APS免疫调节机制的研究现状
• 1.4.4 对巨噬细胞功能的影响
• 1.4.5 对淋巴细胞功能的影响
• 1.4.6 对NK细胞的影响
• 1.4.7 对细胞因子的作用
• 1.4.8 对机体第二信使水平的影响
• 1.5 本论文研究意义和主要工作
• 参考文献
• 2.黄芪多糖对刺参免疫细胞溶菌酶基因表达量和吞噬功能的影响
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及设备
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要设备
• 2.2.4 分析软件
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 β-actin基因部分片段的克隆
• 2.3.2 半定量检测APS对刺参溶菌酶基因mRNA表达量的影响
• 2.3.3 免疫细胞的采集
• 2.3.4 细胞形态研究
• 2.3.5 吞噬活性研究
• 2^-）产生研究'>2.3.6 超氧阴离子（O₂^-）产生研究
• 2.3.7 数据统计分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 刺参β-actin基因片段的克隆与分析
• 2.4.2 APS对刺参体腔细胞溶菌酶mRNA表达量的影响
• 2.4.3 生理盐水对刺参体腔细胞溶菌酶mRNA表达量的影响
• 2.4.4 细胞形态研究
• 2.4.5 APS对吞噬细胞吞噬率的影响
• 2.4.6 APS对吞噬细胞吞噬指数的影响
• 2^-）产生的影响'>2.4.7 APS对超氧阴离子（O₂^-）产生的影响
• 2.5 讨论
• 2.5.1 APS对溶菌酶基因表达的影响
• 2.5.2 APS对吞噬细胞功能的影响
• 2.5.3 APS免疫促进作用机理
• 2.5.4 多糖类免疫增强剂免疫抑制的机理
• 2.6 小结
• 参考文献
• 3 饲喂黄芪和黄芪多糖对刺参非特异性免疫力的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 设备
• 3.2.4 养殖装置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 饲料制备
• 3.3.2 实验设计
• 3.3.3 细胞吞噬率测定
• 3.3.4 超氧阴离子测定
• 3.3.5 血清酚氧化酶活力测定
• 3.3.6 血清溶菌酶活力测定
• 3.3.7 血清酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活力测定
• 3.3.8 血清凝集素效价测定
• 3.3.9 攻毒试验
• 3.3.10 数据分析
• 3.4 结果
• 3.4.1 黄芪和APS对吞噬率的影响
• 2^-产生的影响'>3.4.2 黄芪和APS对O₂^-产生的影响
• 3.4.3 黄芪和APS对血清酚氧化酶活力的影响
• 3.4.4 黄芪和APS对血清溶菌酶活力的影响
• 3.4.5 黄芪和APS对血清ACP活力的影响
• 3.4.6 黄芪和APS对血清ALP活力的影响
• 3.4.7 黄芪和APS对血清凝集素效价的影响
• 3.4.8 黄芪和APS对刺参抗病力的影响
• 3.5 讨论
• 3.5.1 黄芪和APS对刺参吞噬率的影响
• 2^-产生的影响'>3.5.2 黄芪和APS对刺参O₂^-产生的影响
• 3.5.3 黄芪和APS对刺参酚氧化酶活力的影响
• 3.5.4 黄芪和APS对刺参溶菌酶活力的影响
• 3.5.5 黄芪和APS对刺参ACP和ALP活力的影响
• 3.5.6 黄芪和APS对刺参凝集素效价的影响
• 3.5.7 黄芪和APS对刺参抗病力的影响
• 3.5.8 不同处理方式的黄芪应用效果
• 3.6 小结
• 参考文献
• 4 饲喂黄芪和黄芪多糖对刺参生长性能的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 设备
• 4.2.4 实验装置
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 饲料制备
• 4.3.2 实验设计
• 4.3.3 生长指标的测定
• 4.3.4 体壁一般营养成分的测定
• 4.3.5 粗酶液制备
• 4.3.6 消化酶活力测定
• 4.3.7 蛋白质浓度测定
• 4.3.8 肠道菌株的分离与培养
• 4.3.9 体外实验菌株的初筛
• 4.3.10 体外实验菌株的复筛
• 4.3.11 褐藻酸酶活力测定
• 4.3.12 数据的统计分析
• 4.4 结果
• 4.4.1 黄芪和APS对刺参SGR的影响
• 4.4.2 黄芪和APS对脏壁比的影响
• 4.4.3 黄芪和APS对体壁一般营养成分的影响
• 4.4.4 黄芪和APS对消化酶活力的影响
• 4.4.5 体内实验中细菌在平板上的生长
• 4.4.6 体内实验中产褐藻酸酶菌在肠壁总异养菌中的比值
• 4.4.7 体内实验中产褐藻酸酶菌在肠道泥样总异养菌中的比值
• 4.4.8 体外实验中菌种筛选
• 4.4.9 体外实验中APS对产酶菌生物量和酶活力的影响
• 4.5 讨论
• 4.5.1 黄芪和APS对提高刺参SGR的机制
• 4.5.2 黄芪和APS对脏壁比的影响
• 4.5.3 黄芪和APS对体壁主要成分的影响
• 4.5.4 黄芪和APS对消化酶活力的影响
• 4.5.5 黄芪和APS对肠道产褐藻酸酶菌生物量的影响
• 4.5.6 不同浓度的APS对产褐藻酸酶菌生物量和产酶活力的影响
• 4.5.7 消化酶活力与生长的关系
• 4.6 小结
• 参考文献
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 创新点摘要
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
• 个人简历