奶山羊短链脂肪酸受体GPR41基因的克隆分析与腺病毒RNA干扰载体构建

论文摘要

GPR41（G protein-coupled receptor 41）和GPR43（G protein-coupled receptor 43）是生物体内G蛋白偶联受体超家族的成员,其可以被短链脂肪酸（short chain fatty acids, SCFA, C≤6）激活,研究表明GPR41和GPR43与短链脂肪酸结合对脂代谢具有潜在的调控作用。本实验采用RT-PCR方法克隆了奶山羊短链脂肪酸受体GPR41的CDS区,利用实时定量PCR方法检测奶山羊不同组织GPR41表达情况,用短链脂肪酸盐处理山羊乳腺上皮细胞,分析短链脂肪酸盐对GPR41及脂代谢相关基因的影响。同时构建了奶山羊GPR41基因重组腺病毒RNA干扰载体,为GPR41基因功能研究及其对GPR43基因及其他脂代谢基因的表达调控分析提供实验依据。本研究主要获得以下结果:（1）克隆得到奶山羊GPR41基因CDS区,GenBank收录号为:HM013824。山羊乳腺GPR41基因CDS区全长为978bp,编码326个氨基酸;经过同源性分析发现奶山羊的GPR41基因CDS核苷酸序列与牛、人和小鼠的相似性分别为96%、78%和74%,氨基酸的相似性分别为97%、76%和74%;跨膜结构分析发现GPR41有7个跨膜区;SignalP预测分析表明,GPR41的信号肽序列位于1-34AA,可能的切割位点是在34AA与35AA之间。（2） GPR41基因在奶山羊小肠、乳腺、脾脏、瘤胃、皮下脂肪和肝脏等6个组织中的表达分析发现,奶山羊泌乳期该基因在小肠中表达最高,乳腺组织次之,肝脏组织最低,干奶期在肝脏中表达最高,小肠次之,乳腺表达量最低。（3）用丙酸盐和丁酸盐处理乳腺上皮细胞后能够明显观察到脂质积累。实时定量PCR法检测结果表明,丙酸盐处理奶山羊乳腺上皮细胞后引起GPR43、LEPR、TIP47、ATGL和HFABP基因表达上调,GPR41和SREBP基因表达下调;丁酸盐处理乳腺上皮细胞后导致除GPR41基因外所有其他检测基因表达上调。（4）采用美国Invitrogen公司的BLOCK-iTTM shRNA腺病毒干扰系统,根据奶山羊GPR41基因序列,设计并合成了3对shRNA干扰序列（shRNA-197、shRNA-442及shRNA-951 ）将模板退火形成双链后,构建这三个shRNA的穿梭载体pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA,将这3个穿梭载体与表达目的基因的红色荧光蛋白载体pDsRed1-C1-GPR41共转染HEK-293细胞成功筛选出两条有效干扰序列（shRNA-197及shRNA-951）,通过同源重组构建重组载体pAd-shRNA-197和pAd-shRNA-951,并在HEK 293细胞中包装出腺病毒颗粒。综上所述,本研究首次克隆了GPR41基因,并经核苷酸和氨基酸比对分析发现其与人、牛、鼠的GPR41基因相似性均较高;奶山羊不同组织和不同时期GPR41基因的表达情况表明GPR41可能与奶山羊的泌乳生理相关;用丙酸盐和丁酸盐处理奶山羊乳腺上皮细胞可促进乳腺细胞脂质的积累并引起相关基因的表达量变化。构建的GPR41基因重组腺病毒干扰载体为该基因功能的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 短链脂肪酸的概述
• 1.1.1 短链脂肪酸的生成
• 1.1.2 短链脂肪酸的吸收和作用
• 1.2 G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）概述
• 1.2.1 GPCRs 分类和基本结构
• 1.2.2 GPCRs 的寡聚化及其功能
• 1.3 短链脂肪酸受体GPR41 和GPR43 的研究进展
• 1.3.1 GPR41 和GPR43 的简介
• 1.3.2 GPR41 和GPR43 的克隆和结构特点
• 1.3.3 短链脂肪酸受体GPR41 和GPR43 的组织表达
• 1.3.4 GPR41 和GPR43 的信号转导模式
• 1.3.5 短链脂肪酸受体GPR41 和GPR43 的功能
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 奶山羊GPR41 基因的CDS 区克隆、序列分析及组织表达分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 奶山羊乳腺组织总RNA 的提取
• 2.2.2 第一链cDNA 合成
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 奶山羊GPR41 基因CDS 的PCR 扩增
• 2.2.5 奶山羊GPR41 基因PCR 产物片段的回收
• 2.2.6 目的基因的连接、转化和鉴定
• 2.2.7 序列生物信息学分析
• 2.2.8 山羊GPR41 基因组织表达分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 奶山羊乳腺总RNA 的提取
• 2.3.2 奶山羊GPR41 基因的克隆
• 2.3.3 奶山羊GPR41 基因同源性分析
• 2.3.4 奶山羊GPR41 蛋白的结构预测分析
• 2.3.5 奶山羊GPR41 基因组织表达分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于GPR41 的克隆与序列分析
• 2.4.2 关于GPR41 蛋白的结构分析
• 2.4.3 关于GPR41 组织表达分析
• 2.5 小结
• 第三章 短链脂肪酸盐对奶山羊乳腺上皮细胞GPR41 及脂代谢相关基因的影响
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 实验所需溶液的配制
• 3.2.2 奶山羊乳腺上皮细胞的培养
• 3.2.3 奶山羊乳腺上皮细胞的处理
• 3.2.4 油红O 染色
• 3.2.5 细胞总RNA 的提取
• 3.2.6 第一链cDNA 的合成
• 3.2.7 实时定量引物设计
• 3.2.8 脂代谢相关基因的实时定量分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 油红O 染色结果分析
• 3.3.2 山羊乳腺上皮细胞RNA 提取
• 3.3.3 RT-qPCR 分析脂肪代谢相关基因
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 奶山羊GPR41 基因RNA 干扰序列的筛选及其重组腺病毒载体的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 奶山羊GPR41 基因的shRNA 干扰序列的设计与合成
• 4.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 穿梭载体的构建
• 4.2.3 pDsRed1-GPR41 表达载体的构建
• 4.2.4 筛选shRNA 有效序列
• 4.2.5 pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA 重组腺病毒载体的构建及鉴定
• 4.2.6 腺病毒的包装与扩增
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建
• 4.3.2 pDsRed1-C1-GPR41 载体的构建
• 4.3.3 有效的干扰 shRNA 序列的筛选
• 4.3.4 pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA 重组载体的构建及鉴定
• 4.3.5 腺病毒的包装、扩增
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介