交配反应与简并PCR在黑木耳遗传分析中的应用

论文摘要

本研究室在前期对全国黑木耳主要栽培菌株进行酯酶同工酶和DNA分子指纹（ISSR、SRAP）分析中发现，部分菌株如新科1号与新科5号、菌株139与菌株8129的相似水平较高，极可能存在同物异名现象。为了深入研究黑木耳栽培菌株的鉴别技术和方法，本课题采用交配反应和简并PCR技术，对部分黑木耳栽培菌株的亲本及F1代进行了遗传分析。本研究以栽培菌株新科1号与新科5号（第Ⅰ组）、139与8129（第Ⅱ组）、新科5号与黑29（第Ⅲ组）为材料，分别通过原生质体单核化和单孢分离技术得到亲本及其F1代单核体，鉴定交配型。分别对各组材料进行菌株内、菌株间F1代单核体-亲本的交配试验，统计亲和率。以每组两对亲本与各菌株F1代单核体的亲和情况为基准，计算亲本交配型因子的遗传相似性系数并进行聚类分析。结果表明：第Ⅰ组菌株新科1号与新科5号交配型基因很相似，XK1-S70与XK5-P55的遗传相似性系数达0.96，XK1-P11与XK5-P32之间为0.75。同样，第Ⅱ组菌株139-S46与8129-S22、139-S13与8129-S8的遗传相似性系数分别为0.93、0.86。第Ⅲ组菌株黑29与新科5号的单核体配对，均可亲和。新科5号亲本与子代的比较分析表明，经过减数分裂阶段担孢子染色体组的交换，子代的交配型基因发生了一定的遗传重组。结果表明，黑木耳菌株间交配型座位内的等位基因存在不同程度的差异，其中第Ⅰ、Ⅱ组菌株等位基因的相似程度较高，第Ⅲ组菌株的差异较大；交配型因子存在着遗传变异现象；交配型标记应用于菌株鉴别具有可行性。应用ISSR分子标记对黑木耳单核体进行了遗传分析。从73条ISSR引物中筛选出13条可区分新科5号亲本单核体（T1、T2）的引物，对新科5号及F1代孢子单核体进行扩增，共扩增出70条带，其中63条在供试菌株间表现出多态性，多态位点百分率为90.0％。根据扩增结果采用软件NTsys 2.10e计算遗传相似系数并进行聚类分析，36个供试材料间的GS值变化范围为0.25～0.83，其中T1和T2之间的GS值最小，遗传相似程度最低；F1代33个孢子单核体中24个与T1聚为一类，其余9个与T2聚为另一类，但并非严格按照交配型进行归类。试验表明黑木耳子实体上各个担子在减数分裂中染色体交换极具多样性，F1代单核体表现出偏向其中一个亲本的现象，而交配型因子可能由可交换的亚单位组成。为获得与黑木耳交配型基因相关的分子标记，本研究采用依据信息素受体的保守氨基酸序列设计的简并引物组合br1-F与br1-R进行扩增，得到一条约775bp的特异性条带。序列分析显示该片断属于ste3信息素受体。分析比较发现，不同菌株及不同交配型单核体的信息素受体基因差异不大。同样，利用简并PCR在新科5号单核体中扩增得到一条约2590bp的特异性条带，SOSUI软件分析表明该序列为包含2个跨膜螺旋的膜蛋白；BLASTX程序搜索表明其后850bp可能编码短链脱氢酶，且找到符合信息素基因中内含子分布规律的核酸序列，表明该序列可能包含黑木耳信息素基因下游端的序列。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 生物学特性
• 2 遗传标记及其在食用菌遗传分析中的应用
• 2.1 形态标记
• 2.2 细胞学标记
• 2.3 生化标记
• 2.4 DNA分子标记
• 3 交配型研究
• 3.1 交配系统
• 3.2 黑木耳的极性问题
• 3.3 交配型标记
• 3.4 简并引物扩增
• 4 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 1.3 供试试剂
• 1.3.1 原生质体制备用试剂
• 1.3.2 荧光染色试剂
• 1.3.3 DNA提取系列试剂
• 1.3.4 PCR反应系列试剂
• 1.3.5 感受态细胞制备及克隆用试剂
• 1.4 仪器与设备
• 2 试验方法
• 2.1 原生质体单核化
• 2.1.1 菌丝体的培养
• 2.1.2 酶解反应
• 2.1.3 原生质体纯化及再生
• 2.1.4 原生质体单核体交配型鉴定
• 2.2 单孢分离
• 2.2.1 孢子的收集
• 2.2.2 孢子单核体的制备
• 2.2.3 交配型的鉴定
• 2.3 交配试验
• 1代交配试验'>2.3.1 同一菌株内的亲本-F₁代交配试验
• 1代交配试验'>2.3.2 菌株之间的亲本-F₁代交配试验
• 2.4 单核体的遗传分析
• 2.4.1 菌丝培养及收集
• 2.4.2 DNA的提取
• 2.4.3 DNA的检测
• 2.4.4 ISSR引物筛选
• 2.4.5 PCR扩增
• 2.4.6 数据处理
• 2.5 简并引物扩增
• 2.5.1 DNA的制备
• 2.5.2 PCR反应体系
• 2.5.3 电泳检测
• 2.5.4 克隆与测序
• 2.5.5 序列分析比较
• 第三章 结果与分析
• 1 原生质体单核化
• 1.1 原生质体单核化菌株的再生情况
• 1.2 原生质体单核体交配型分析
• 2 单孢分离
• 2.1 孢子萌发及镜检
• 3 交配试验
• 3.1 新科1号与新科5号
• 3.2 菌株139和菌株8129
• 3.3 新科5号与黑29
• 3.6 数据处理与分析
• 3.6.1 新科1号与新科5号配对试验分析
• 3.6.2 新科5号菌株亲本与子代的相似性分析
• 3.6.3 菌株139与菌株8129的配对试验分析
• 3.6.4 新科5号与黑29配对试验分析
• 4 单核体的遗传分析
• 4.1 供试菌株
• 4.2 引物筛选
• 4.3 ISSR分析
• 4.4 遗传相似系数
• 4.5 聚类分析
• 5 简并引物扩增
• 5.1 br1F与br1R扩增
• 5.1.1 扩增特异性条带
• 5.1.2 克隆及测序
• 5.1.3 序列分析
• 5.1.4 各菌株序列比较
• 5.2 引物组合Hox1F与Hox1R的扩增
• 5.2.1 扩增产物及序列
• 5.2.2 序列分析
• 第四章 讨论
• 1 关于黑木耳交配型因子偏分离现象
• 2 交配型标记
• 2.1 配对试验
• 2.2 关于交配型标记在黑木耳菌株鉴别中的应用
• 3 序列标记
• 3.1 简并PCR
• 3.1.1 引物的选择
• 3.1.2 扩增产物的分析
• 3.2 利用序列标记进行菌株鉴别的复杂性
• 3.3 关于序列标记的应用前景
• 4 数据处理
• 4.1 关于交配型标记中的数据处理
• 4.2 关于序列标记的数据处理
• 5 ISSR标记及其在黑木耳单核体遗传分析中的应用
• 参考文献（References）
• 致谢
• 在读期间发表与课题相关的文章