黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对锦鲤及原代培养肝细胞的毒性研究

论文摘要

真菌毒素是由真菌产生的有毒次级代谢产物,广泛污染各种饲料及饲料原料。动物摄入被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一大类结构相似的次级代谢产物,是目前已知的最稳定、毒性最强的毒素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是禾谷镰刀菌在生长过程中产生的一种主要代谢产物,是单端孢霉烯族毒素的一种,毒性和黄曲霉毒素相比较弱,但广泛存在于各种谷物和饲料。本论文主要研究这两种毒素在常规剂量下对锦鲤的毒性作用,分别从体内试验和体外试验两个方面对两种毒素单独和联合作用对锦鲤的毒性作用进行了研究。试验Ⅰ江苏省水产饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B,和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染情况调查分别从江苏省各地（扬州、盐城、苏州和徐州等）收集的水产饲料及饲料原料,其中粉状料15份,颗粒料15份。毒素经提取净化后,HPLC检测含量。测定结果表明,在粉状料和颗粒料中,AFB1的阳性检出率分别为40%和26.7%,DON的阳性检出率均为100%,从真菌毒素的绝对含量来看,AFB1的最高含量为16.4μg kg-1,低于国家规定的饲料及饲料原料最大允许量kg-1);而DON的最高含量为7046μg kg-1,高于国家配合饲料允许含量标准（1000μg kg-1）.试验Ⅱ黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀茵烯醇对锦鲤生长性能、血液生化和组织病理学的影响锦鲤270尾（均重为18±0.1g）,分为9组,每组10尾,每组设三个平行,2个平行组进行试验观察和统计,1个平行组作为试验过程中解剖检查用（在第1、20、40天各取样3尾剖检）。分别饲喂基础日粮、基础日粮+AFB1 （0.05mg kg-1）基础日粮+AFB1 （0.1mg kg-1）、基础日粮+DON （lmg kg-1）、基础日粮+DON （5mg kg-1）、基础日粮+AFB1 （0.05mg kg-1）+DON （1mg kg-1）、基础日粮+AFB1（0.05mg kg-1）+DON （5 mg kg-1）、基础日粮+AFB1（0.1 mg kg-1）+DON （1 mg kg-1）、基础日粮+AFB1（0.1mg kg-1）+DON （5mg kg-1）.试验为期40天。每20天进行体重、体长、丰满系数、肝胰脏重／体重比、血清生化指标检测（ALP、ALB、ALT、AST、TP）以及肝胰脏、脾脏和肠道的组织学检查。试验结果表明：不管是毒素单独作用还是联合作用,均能不同程度的引起锦鲤生长性能的降低,并表现出体重、丰满系数的下降,血清生化指标的变化和组织的病理学损伤。随着毒素浓度的升高,毒素的毒性作用显著增加,具有明显的剂量-效应关系。和毒素单独作用相比,两种毒素联合作用后毒性明显大于一种毒素单独作用,具有一定的协同作用。试验Ⅲ锦鲤原代肝细胞的分离及原代培养条件的优化在本试验中,选用三种不同的细胞分离方法（机械分离法、胶原酶灌注法和胰酶-EDTA消化法）来获得肝细胞,并将其置于三种不同的培养基中（DMEM, M199和L-15）,在不同的培养条件下（17℃、27℃和37℃,5%CO2供应和无CO2供应）进行培养,细胞培养时间为7天,筛选出最方便、实用的锦鲤肝细胞的原代分离培养方法。结果表明：采用胰酶-EDTA消化法来分离细胞,并将得到的肝细胞用L-15培养基（无C02供应）或M199培养基（有5%C02供应）于27℃培养可获得状态良好的肝细胞,满足进行毒理学试验的要求。试验Ⅳ黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对锦鲤原代培养肝细胞的毒性作用的研究在试验Ⅲ的基础上,对分离得到的肝细胞进行培养,分别设置AFB1组（0.01μgmL-1和0.02μg ml-1）,DON组（125ng ml-1、250ngmL-1、500ngmL-1、1000ngmL-1和2000 ngmL1），联合毒性组（0.01+125、0.01+250、0.01+500、0.02+125、0.02+250和0.02+500,单位分别为μgmL-1和ng mL-1）,试剂对照组（DMSO:2，μLmL-1）及空白对照组,每隔2h,从细胞形态学、酶活性和细胞毒性三个方面研究这两种真菌毒素对锦鲤原代培养肝细胞的单独和联合毒性作用,试验时间为24h。试验结果表明：光学显微镜下发现两种毒素均能在短时间内引起细胞的大量死亡,各试验组均与对照组之间差异显著。在电镜下,和对照组相比,低浓度联合毒性组和DON组均能发现数量不等的凋亡细胞,而低浓度的AFB1组则仅见个别凋亡的肝细胞。试验V黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和两种毒素联合作用对锦鲤原代肝细胞DNA损伤的研究在本试验中,分别采用单细胞凝胶电泳和DNA ladder两种方法对毒素引起的细胞凋亡情况进行了研究。用单细胞凝胶电泳进行研究的结果是,肝细胞凋亡率最高的为联合毒素组[AFB1+DON:0.02（μg mL-1）+125（ngm-1）]组,其次为DON 500ng mL-1组,再次为AFB1+DON:0.01 （μg mL-1）+125 （ng mL-1）组。用DNA ladder进行研究时发现,DON（<500ng mL-1）和低浓度的联合毒素[AFB1+DON:0.01 （μg mL-1）+125 （ng mL-1）和AFB1+DON:0.02 （μgmL-1）+125 （ngmL-1）]可以引起锦鲤肝细胞的明显凋亡,在2.5%琼脂糖电泳凝胶上呈梯状,其它剂量的毒素则不能检测到凋亡的存在。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语
• 第一部分 文献综述
• 第一章 真菌毒素概述
• 1 我国真菌毒素的污染情况
• 2 真菌毒素对农产品及其加工制品的污染
• 3 真菌毒素毒性效应的影响因素
• 3.1 动物因素
• 3.1.1 动物品种差异
• 3.1.2 动物基因型的差异
• 3.1.3 动物的年龄和性别
• 3.2 真菌毒素的协同作用
• 3.2.1 真菌毒素互作效应的分类
• 3.2.2 黄曲霉毒素和镰刀菌毒素之间的互作效应
• 3.2.3 赭曲霉毒素和其他真菌毒素之间的互作效应
• 1和其他镰刀菌毒素之间的互作效应'>3.2.4 烟曲霉毒素B₁和其他镰刀菌毒素之间的互作效应
• 3.2.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和其他镰刀菌毒素之间的互作效应
• 3.3 营养因素
• 3.3.1 粗蛋白
• 3.3.2 添加蛋氨酸
• 3.3.3 添加苯丙氨酸
• 3.3.4 日粮脂肪
• 3.3.5 添加维生素
• 3.4 饲料添加剂
• 3.4.1 抗生素
• 3.4.2 抗氧化剂
• 3.4.3 真菌毒素吸附剂
• 参考文献
• 第二章 水产饲料中常见的真菌毒素及其毒性
• 1 黄曲霉毒素
• 2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇
• 3 其他真菌毒素
• 3.1 玉米赤霉烯酮
• 3.2 T-2毒素
• 3.3 HT-2毒素
• 3.4 雪腐镰刀菌烯醇
• 3.5 赭曲霉毒素
• 参考文献
• 第三章 真菌毒素与细胞凋亡
• 1 细胞凋亡的生物学特征
• 1.1 形态特征
• 1.2 生物化学特征
• 1.2.1 内源性核酸内切酶与DNA片段化
• 1.2.2 线粒体与细胞凋亡
• 2 凋亡的主要调控基因
• 3 细胞凋亡的检测
• 3.1 细胞凋亡的形态学检测方法
• 3.2 细胞凋亡生化及免疫检测方法
• 3.3 凋亡细胞的分子生物学检测方法
• 4 真菌毒素与细胞凋亡
• 4.1 DON与细胞凋亡
• 4.2 黄曲霉毒素
• 4.3 玉米赤酶烯酮
• 参考文献
• 第二部分 试验研究
• 1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染情况调查'>第四章 江苏省水产饲料中黄曲霉毒素B₁和脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染情况调查
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 检测样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要设备
• 1.4 检测方法
• 1.4.1 样品的提取与净化
• 1.4.2 高效液相色谱分析
• 2 结果
• 2.1 AFB1标准曲线的绘制
• 2.2 DON标准曲线的绘制
• 2.3 样品测定结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及两种毒素联合对锦鲤的影响'>第五章 黄曲霉毒素B₁、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及两种毒素联合对锦鲤的影响
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂及仪器
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 试验用鱼
• 1.3.2 基础日粮
• 1.3.3 试验日粮
• 1.3.4 饲养条件
• 1.3.5 饲养管理
• 1.3.6 测定指标
• 2 结果
• 2.1 锦鲤的采食状况和死亡情况
• 2.2 锦鲤生长性能的变化
• 2.3 肝胰重/体重比的变化
• 2.4 血清生化指标的变化
• 2.5 组织器官的病理变化
• 2.5.1 器官病变
• 2.5.2 组织切片
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 锦鲤肝细胞的分离及原代培养条件的优化
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物及试验设备
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 肝细胞的分离及纯化
• 1.2.2 肝细胞培养模式
• 1.2.3 肝细胞培养条件的优化
• 2 结果
• 2.1 细胞产量和成活率
• 2.2 形态学观察
• 2.3 细胞生长曲线的确定
• 3 讨论
• 参考文献
• 1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对锦鲤原代肝细胞毒性作用的研究'>第七章 黄曲霉毒素B₁和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对锦鲤原代肝细胞毒性作用的研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 主要试剂与设备
• 1.2 方法
• 1母液的配制'>1.2.1 AFB₁母液的配制
• 1.2.2 DON母液的配制
• 1.2.3 剂量设置
• 1对肝细胞生长状态及酶活性的影响'>1.2.4 AFB₁对肝细胞生长状态及酶活性的影响
• 1.2.5 DON对肝细胞生长状态及酶活性的影响
• 1.2.6 两种毒素联合对锦鲤原代肝细胞的生长状态及酶活性的影响
• 2 结果
• 1对肝细胞生长状态及酶活性的影响'>2.1 AFB₁对肝细胞生长状态及酶活性的影响
• 2.1.1 光学显微镜
• 2.1.2 透射电子显微镜
• 2.1.3 血清酶活性
• 2.1.4 细胞增殖抑制率
• 2.2 DON对肝细胞生长状态及酶活性的影响
• 2.2.1 光学显微镜
• 2.2.2 透射电子显微镜
• 2.2.3 血清酶活性
• 2.2.4 细胞增殖抑制率
• 2.3 两种毒素联合对锦鲤原代肝细胞的生长状态及酶活性的影响
• 2.3.1 光学显微镜
• 2.3.2 透射电子显微镜
• 2.3.3 血清酶活性
• 2.3.4 细胞增殖抑制率
• 3 讨论
• 参考文献
• 1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和两种毒素对锦鲤原代培养肝细胞DNA损伤的研究'>第八章 黄曲霉毒素B₁、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和两种毒素对锦鲤原代培养肝细胞DNA损伤的研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与设备
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 肝细胞接种毒素
• 1.2.2 单细胞凝胶电泳用肝细胞的制备
• 1.2.3 DNA ladder用肝细胞DNA的制备
• 1.2.4 单细胞凝胶电泳法
• 1.2.5 DNA ladder法
• 2 结果
• 2.1 单细胞凝胶电泳
• 2.2 DNA ladder
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 全文创新点
• 攻读博士期间发表的论文及其它
• 附录
• 致谢