氟比洛芬酯对大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤的保护作用及机制研究

论文摘要

短暂或永久的局部脑血流减少可导致脑组织缺血性损害。脑缺血疾病因其高达30%的死亡率,是人类死亡和致残的首要原因。然目前尚缺乏有效的防治方法,中风病人的预后效果较差。为了探索新的脑保护措施,更多的科学家聚焦于脑缺血损伤的病理生理机制研究。近来发现脑缺血后较长时间内损伤仍进行性发展,在延迟性脑损伤中起关键作用的是“缺血后炎症反应”。表现为缺血区域血管内炎性细胞聚集、粘附,血脑屏障（BBB）破坏,炎性细胞跨BBB迁移,组织中淋巴细胞、中性粒细胞浸润,进而触发大量促炎因子瀑布状释放,化学增活素和粘附分子高表达,造成局部炎症反应。“减轻脑缺血后延迟性损伤”即“抑制脑缺血后炎性反应”已成为新近脑保护研究的热点,炎症相关的酶类[如:诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶（COX）]在脑缺血后延迟性损伤中起重要作用,故近年COX或COX-2抑制剂的脑保护作用备受关注。虽已有研究证实特异性抑制COX-2具有明显的神经保护效果,然而在临床使用COX-2抑制剂过程中,由于其破坏了前列环素（PGI2）和血栓素A2（TXA2）的平衡,导致某些严重副作用的发生,使其应用受到限制。人们又将注意力集中于非选择性COX抑制剂脑保护,因为前者在抗炎的同时维持PGI2和TXA2的平衡。因此,近年COX抑制剂的脑缺血保护备受关注。氟比洛芬酯（FA）作为非选择性COX抑制剂代表药物之一,广泛应用于临床炎性疾病及疼痛治疗,然而,关于该药物的脑缺血后神经保护作用国内外未见报道,本研究拟通过大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型证实:氟比洛芬酯对脑缺血后的保护作用,并探讨其可能机制。第一部分氟比洛芬酯对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用及时间窗实验一氟比洛芬酯（FA）对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用方法48只清洁级雄性SD大鼠,随机均分为六组（n = 8）,即C组为缺血-再灌注组（I/R）; S组（假手术组） ;F1组（I/R +FA 5mg/kg）、F2组（I/R +FA 10mg/kg）、F3组（I/R+FA 20mg/kg ）、L组脂微球对照组（I/R +Lip）分别在大脑中动脉阻闭（MCAO） 120min再灌注即刻经尾静脉给予FA 5,10,20mg/kg或脂微球对照剂1ml/kg。再灌注24,48,72 h进行神经缺陷评分（Garcia法）并于72 h评分后处死动物,取大脑切片行10 g/l 2,3,5-氯化三苯四唑（TTC）染色,测量并计算脑梗死容积百分比。结果神经缺陷评分: FA各处理组72h NDS,F1组10.0（7-13）,F2组12.0（10-15）,F3组11.5（13-16）明显高于C组7.0（6-10） （p<0.05）;F1、F2、F3组间24,48,72 h神经功能评分无差别,L组与C组差异无统计学意义。梗死容积百分比:F1组（34.94±3.52）%,F2组（23.52±9.90）%,F3组（25.53±9.46）%明显小于C组的（47.07±10.36）% （p<0.01）; F2、F3组明显低于F1组（p<0.05） ;L组与C组差异无统计学意义。实验二氟比洛芬酯对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用时间窗方法32只雄性SD大鼠随机均分为4组（n = 8）,即C组为缺血-再灌注组（I/R）;F6h组,F12h组和F24h组分别在MCAO 120min再灌注6h,12h,24h经尾静脉给予FA10mg/kg。再灌注72 h进行神经缺陷评分（Garcia法）完成后处死动物,取大脑切片行10 g/l TTC染色,测量并计算脑梗死容积百分比。结果神经缺陷评分: F6h组10.5（7-13）,F12h组9.5（7-14）明显高于C组7.0（6-10） （p<0.05） ;F24h组与C组差异无统计学意义。梗死容积百分比:F6h组（25.56±10.69）%,F12h组（33.69±14.42）%明显小于C组的（47.07±10.36）% （p<0.01） ;F24h组与C组差异无统计学意义。第二部分氟比洛芬酯对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的机制研究实验三PPAR-γ对FA减轻大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤作用的影响方法48只雄性SD大鼠随机均分为6组（n =8）,即缺血-再灌注组（I/R）;I/R +FA组在MCAO120min,再灌注开始即刻经尾静脉给予FA10mg/kg;I/R+FA+GW9662组在MCAO前30min腹腔给予PPAR-γ的拮抗剂GW9662 4mg/kg,MCAO120min再灌注开始即刻经尾静脉给予FA10mg/kg; I/R+GW9662组在MCAO前30min腹腔给予PPAR-γ的拮抗剂GW9662 4mg/kg,大鼠行MCAO120min;I/R+FA+DMSO组在MCAO前30min腹腔给予3% DMSO（GW9662的溶媒）4ml/kg,MCAO120min再灌注开始即刻经尾静脉给予FA10mg/kg;Sham组行除外颈总动脉栓线的MCAO操作。再灌注72 h神经缺陷评分完成后（Garcia法）处死动物,取大脑切片行10 g/l TTC染色,测量并计算脑梗死容积百分比。结果神经缺陷评分:I/R与I/R+FA组,I/R+FA+GW9662组,相比,差异有统计学意义（p<0.05）;I/R+FA组,I/R+FA+GW9662组与I/R+FA+DMSO组差异无统计学意义（p>0.05）。梗死容积百分比:I/R组（47.07±3.66）%明显大于I/R +FA组（23.52±3.50）%,I/R +FA+GW9662组（33.17±2.53）%（p<0.01）;I/R +FA组（23.52±3.50）%明显小于I/R +FA+GW9662组（33.17±2.53）% （p<0.05）,I/R+FA组与I/R+FA+DMSO组差异无统计学意义。实验四PPAR-γ参与FA减轻大鼠局灶性脑缺血-再灌注后血脑屏障的破坏方法48只雄性SD大鼠随机均分为6组（n = 8）,即缺血-再灌注组（I/R）;I/R+FA组MCAO120min,再灌注开始即刻经尾静脉给予FA10mg/kg;I/R+FA+GW9662组在MCAO前30min腹腔给予PPAR-γ的拮抗剂GW9662 4mg/kg,MCAO120min再灌注开始即刻经尾静脉给予FA10mg/kg; I/R+GW9662组在MCAO前30min腹腔给予PPAR-γ的拮抗剂GW9662 4mg/kg;I/R+FA+DMSO组在MCAO前30min腹腔给予3% DMSO（GW9662的溶媒）4ml/kg,MCAO120min再灌注开始后即刻经尾静脉给予FA10mg/kg;假手术组（sham）行除外颈总动脉栓线的MCAO操作。各组动物均在再灌注46h经股静脉给予2%伊文氏蓝（evans blue;EB）4ml/kg;2h后经心脏快速灌注0.9%氯化钠400ml,断头分别取脑左右皮层及海马,称重后加入50%三氯乙酸,低温匀浆离心后取上清液加入无水乙醇,分光光度仪检测其吸光度值,通过标准曲线计算出EB含量并进行统计学分析。结果右侧海马:I/R组EB含量（95.08±3.67μg/g组织）明显高于I/R+FA组（36.54±2.10μg/g组织）,I/R+FA+GW9662组（44.03±2.11μg/g组织）,I/R+ GW9662组（106.70±3.59μg/g组织）,Sham组（14.74±0.91μg/g组织）（p<0.000）; I/R+FA组与I/R+FA+GW9662组相比,差异有统计学意义（p<0.05）。右侧皮层:I/R组EB含量（37.99±2.95μg/g组织）明显高于I/R+FA组（20.76±2.19μg/g组织）,I/R+FA+GW9662组（29.61±2.00μg/g组织）,Sham组（8.550±0.93μg/g组织）（p<0.05）;I/R+FA组与I/R+FA+GW9662组相比,差异有统计学意义（p=0.01）;I/R组与I/R+GW9662组相比,差异无统计学意义。左侧皮层和海马各组差异无统计学意义（p>0.05）。结论1. FA对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤具有保护作用,呈剂量依赖关系,存在“封顶现象”,以10mg/kg剂量为最佳2. FA脑保护作用时间窗研究结果显示:再灌注后12h之内给予FA有明显的保护作用,而24h该保护作用消失3. PPAR-γ拮抗剂GW9662可部分削弱FA对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用,提示FA的保护作用部分系通过激动PPAR-γ实现4. FA可明显减轻大鼠局灶性脑缺血后血脑屏障的破坏程度,使用GW9662可减轻前者的保护作用

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1. 脑缺血再灌注损伤的病理生理过程
• 2. 脑缺血-再灌注损伤的研究现状
• 3.环氧合酶抑制剂在神经保护方面的研究进展
• 4. 过氧化物酶体增生物激活受体-γ（PPAR-γ）
• 正文
• 实验材料
• 1 主要仪器
• 2 主要试剂
• 第一部分：氟比洛芬酯对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用及时间窗
• 1 方法
• 2 结果
• 第二部分：氟比洛芬酯对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的作用机制
• 1 方法
• 2 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 个人履历
• 学习期间发表文章
• 致谢