发酵温度对有效霉素生物合成的影响

论文摘要

有效霉素又名井冈霉素,是一种由吸水链霉菌产生的得到广泛应用的重要抗真菌病害农用抗生素。发酵温度是影响发酵过程的一种重要因素,但是有关发酵温度对抗生素发酵过程中基因和酶层次的研究十分有限。本研究以吸水链霉菌5008发酵有效霉素为例,详细考察了在不同温度发酵产生有效霉素A的过程,发现发酵温度在35oC与37oC之间产量存在温度响应阈值。当高于温度阈值时,发酵产量显著高于较低温度的发酵产量,同时发酵的早期蛋白合成和糖消耗速率高。本研究进一步利用qRT-PCR测定了不同发酵温度下发酵前期,中期和后期三个阶段的样品中有效霉素A生物合成必需的8个基因所在的3个操纵子转录水平。研究发现在阈值温度下valABC, valKLMN和valG转录水平迅速提高,其中valKLMN最为显著。同时磷酸戊糖途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶和有效霉素生物合成ValG酶活性测定表明,较高发酵温度下细胞在发酵前期6-磷酸葡萄糖脱氢酶和ValG都具有更高的酶活。论文还通过黄色荧光蛋白原位跟踪温度对valG表达的影响,显示了在不同分化水平的表达差异。在发酵水平,基因和酶水平的一系列实验表明较高温度发酵下,对发酵前期所具备的快速的蛋白合成,高转录水平,旺盛的前体代谢,以及较高的有效霉素A合成代谢酶活力与较高的有效霉素产量具有相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景综述
• 1.1 有效霉素的发现和同系物
• 1.2 有效霉素抗真菌机理及应用
• 1.2.1 有效霉素抗真菌机理
• 1.2.2 有效霉素的应用
• 1.3 有效霉素合成代谢研究进展
• 1.3.1 生物合成途径的研究
• 1.3.2 生物合成基因簇的克隆
• 1.3.3 生物合成代谢途径的推测
• 1.3.4 生物合成代谢途径的调控
• 1.4 有效霉素发酵研究进展
• 1.5 温度对于抗生素发酵的影响
• 1.5.1 温度是发酵过程中的重要因素
• 1.5.2 温度对链霉菌发酵的影响
• 1.5.3 链霉菌对温度响应的机制
• 1.5.4 有效霉素发酵温度研究
• 1.6 本研究的目的、内容和意义
• 1.6.1 本研究的目的和内容
• 1.6.2 本研究的意义
• 第二章 发酵温度对吸水链霉菌 5008 有效霉素 A（井冈霉素）发酵过程的影响
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要试剂与培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 发酵培养物蛋白量测定
• 2.2.3 残糖和pH 的测定
• 2.2.4 有效霉素标准品的制备
• 2.2.5 有效霉素的检测
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 糖的消耗
• 2.3.2 菌体的生长
• 2.3.3 pH 的变化
• 2.3.4 有效霉素的积累
• 2.4 讨论
• 第三章 不同温度条件下有效霉素生物合成相关基因的表达
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂与培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 RNA 提取与反转录
• 3.2.3 扩增条件与标准扩增曲线
• 3.2.4 实时荧光定量PCR
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 RNA 提取
• 3.3.2 引物扩增效率与特异性
• 3.3.3 有效霉素结构基因所在三个转录子的表达水平
• 3.4 讨论
• 第四章 发酵温度对代谢途径相关酶活性的影响
• 4.1 磷酸戊糖途径中G6PDH 酶活性的测定
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.1.1 主要仪器设备
• 4.1.1.2 主要实验试剂
• 4.1.1.3 吸水链霉菌5008 的培养
• 4.1.1.4 粗酶液的制备
• 4.1.1.5 G6PDH 酶活性的测定方法
• 4.1.2 实验结果
• 4.2 有效霉素A 合成途径中ValG 酶活性的测定
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.1.1 主要仪器设备
• 4.2.1.2 实验试剂与材料
• 4.2.1.3 ValG 糖苷转移酶活性测定方法
• 4.2.2 实验结果
• 4.3 讨论
• 第五章 利用荧光蛋白跟踪valG 基因表达的探索
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 菌种与载体
• 5.1.2 试剂溶液和培养基
• 5.1.2.1 试剂
• 5.1.2.2 溶液
• 5.1.2.3 培养基
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 实验方法与步骤
• 5.2.1 常规分子实验技术
• 5.2.2 技术路线
• 5.2.3 片断重叠延伸PCR （SOE PCR）
• 5.2.4 接合转移
• 5.2.5 荧光显微镜成像
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 载体的构建
• 5.3.2 接合转移
• 5.3.3 荧光显微镜成像
• 5.4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢