虾类过敏原的活性分析及其抗原表位的研究

论文摘要

随着现代社会的发展,人们饮食结构的变化,与食物直接相关的过敏疾病发病率日益增高,给人们的生命健康造成了巨大威胁。虾类产品属于我国产值比较高的甲壳类海产品,由于味道鲜美、营养丰富,深受消费者的喜爱。然而虾类海产品属于8大类食物过敏原之一,使许多消费者饱受过敏症状的困扰。本论文着重对虾类过敏原的鉴定和活性消除方法进行研究,结合生物信息学方法进一步分析过敏原的表位区域及氨基酸组成性质,并对表位进行空间定位。主要内容如下:1、以刀额新对虾为研究对象,分离和纯化了分子量为36kD的主要过敏原蛋白,利用基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱对其进行肽质量指纹图谱鉴定,并对得到的结果采用Mascot搜索引擎在NCBInr数据库上进行搜索。结果表明刀额新对虾主要过敏原为原肌球蛋白,与斑节对虾原肌球蛋白匹配分值最高为268,吻合肽段27条,序列覆盖率为65%;与其它无脊椎动物如腐食酪螨、衣鱼等的原肌球蛋白的序列覆盖率也很高。这一结果不仅表明了刀额新对虾与其它甲壳类海产品过敏原存在着高度同源性,而且为其与甲壳类及其它无脊椎动物主要过敏原之间存在严重交叉反应的现象提供了理论依据。2、在鉴定了刀额新对虾的主要过敏原之后,进一步分析了常见热加工方式对其过敏原活性的影响。选取煮、蒸、高压这三种方法,分别处理刀额新对虾不同时间。通过检测总蛋白和主要过敏原含量以及活性的变化,分析对虾类过敏原的影响。结果表明经过三种热处理后,36kD主要过敏原蛋白仍然存在,但其活性有不同程度的下降。在25-35kD区域出现一条新的免疫活性蛋白,但影响不大,全蛋白的免疫活性仍有不同程度的降低。其中高压对活性的降低程度最大,30分钟时免疫活性降低了97%。但质地剖面分析结果表明,高压处理对虾肉质构破坏最大,仍需进一步优化高压处理工艺,在降低虾致敏活性的同时,保持其口感及营养。3、利用生物信息学方法对虾过敏原及其他甲壳类过敏原之间的同源性进行分析,并绘制出系统进化树。结果表明甲壳类过敏原原肌球蛋白氨基酸序列十分保守,序列之间同源性很高。其中斑节对虾、凡纳滨对虾过敏原同褐美对虾主要过敏原Pen a 1的氨基酸序列完全相同。采用DNAstar、AntheProt等生物信息学软件分析Pen a 1的二级结构、亲水性、溶剂可及性、可塑性、抗原指数等多个性质,间接预测线性表位区域,并结合2个在线网站对表位的预测结果进行筛选,得到10个抗原表位后进行表位肽的固相合成。采用竞争Dot-blot方法,利用患者血清对表位肽的活性进行初步验证。结果表明其中8个表位多肽为主要过敏原表位,其中有两个以前未曾有研究者报道过。对表位区域的氨基酸分析中发现精氨酸（R）、酪氨酸（Y）、苯丙氨酸（F）、丝氨酸（S）以及谷氨酸（E）这5种氨基酸在表位区域出现概率很高。4、以猪原肌球蛋白1c1gC为模板,利用SWISS-MODEL以及CPHmodels中相关的同源建模功能对Pen a 1的空间结构进行预测。采用原子平均势能、分子体系动力学分析以及拉氏构象图对建模结果进行评估。结果表明模拟形成的Pen a 1构象有较高的稳定性和合理性。从构象中可以看出, Pen a 1空间结构比较简单,没有复杂的三、四级结构,二级结构主要以α-螺旋为主。从构象方面分析,Pen a 1单链自身形成构象型表位的几率不大,而线性表位在空间中的定位结果也显示基本上线性表位全部暴露在外。5、利用氨基酸突变的方法研究Pen a 1表位中的关键氨基酸,选择Pen a 1中peptide6和peptide10这两条表位肽,将其中的活性氨基酸替代为人或猪原肌球蛋白中相应的非活性氨基酸。采用Dot-blot竞争酶联免疫的方法检测突变表位肽过敏活性的变化,分析对活性影响较大的氨基酸残基。结果表明,Pen a 1中Peptide 10中所对应的表位区域中,278F和279S氨基酸替代为人原肌球蛋白相应位置的氨基酸L后,突变表位肽与过敏患者血清IgE的结合能力有明显的下降,说明这两者为该表位中的关键氨基酸。其他表位中的关键氨基酸还有待于进一步分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 食物过敏概况
• 0.1.1 食物过敏现象及机理
• 0.1.2 食物过敏原分类
• 0.1.3 食物过敏原表位概述
• 0.1.4 食物过敏原的鉴定方法
• 0.1.5 降低食物过敏原活性的方法
• 0.2 过敏原表位分析预测方法
• 0.2.1 生物信息学概述
• 0.2.2 生物信息学在过敏原研究中的应用
• 0.2.2.1 过敏原同源性分析
• 0.2.2.2 过敏原活性评价
• 0.2.2.3 B 细胞线性表位预测方法
• 0.2.2.4 构象表位的预测方法
• 0.3 虾过敏原研究进展
• 0.3.1 虾过敏原种类及性质
• 0.3.2 虾过敏原表位的研究进展
• 0.4 研究目的与意义
• 0.5 研究内容与技术路线
• 1 刀额新对虾过敏原的肽质量指纹图谱鉴定
• 1.1 引言
• 1.2 仪器与试剂
• 1.2.1 实验仪器
• 1.2.2 主要材料与试剂
• 1.2.3 溶液的配制
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 虾蛋白的提取
• 1.3.2 虾丙酮粉的制备
• 1.3.3 虾过敏原蛋白的抽提
• 1.3.4 过敏原蛋白的硫酸铵和等电点沉淀
• 1.3.5 虾过敏原组分和纯度分析
• 1.3.6 虾过敏原蛋白的分离
• 1.3.7 基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱分析
• 1.3.8 肽指纹谱图分析鉴定
• 1.4 结果与讨论
• 1.4.1 刀额新对虾36kD 蛋白的分离纯化
• 1.4.2 肽质量指纹图谱分析
• 1.4.3 检索结果的比较分析
• 1.5 小结
• 2 热加工方法对刀额新对虾过敏原活性的影响
• 2.1 引言
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 主要材料与试剂
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 三种不同热处理方法
• 2.3.2 过敏原蛋白的提取
• 2.3.3 电泳及免疫印记分析过敏原含量
• 2.3.4 ELISA 对过敏原活性进行定量检测
• 2.3.4.1 间接ELISA 检测兔抗虾多克隆抗体的效价
• 2.3.4.2 间接ELISA 法测定热处理后虾过敏原活性
• 2.3.5 处理后虾肉的质构分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 过敏原含量的变化
• 2.4.2 免疫印迹对过敏原活性的检测
• 2.4.3 间接ELISA对过敏原免疫活性的分析
• 2.4.4 质构分析
• 2.5 小结
• 3 虾过敏原线性表位的预测及初步鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 主要材料与试剂
• 3.2.3 溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 虾与其他甲壳类过敏原同源性分析
• 3.3.2 Pen a 1 二级结构分析
• 3.3.3 Pen a 1 氨基酸序列性质分析
• 3.3.3.1 Pen a 1 的亲疏水性分析
• 3.3.3.2 Pen a 1 的可及性分析
• 3.3.3.3 Pen a 1 的可塑性分析
• 3.3.3.4 Pen a 1 的抗原性指数分析
• 3.3.4 Pen a 1 表位的在线工具预测
• 3.3.5 Pen a 1 表位的综合分析预测
• 3.3.6 预测表位多肽的合成及纯度分析
• 3.3.7 合成多肽的二级结构分析
• 3.3.8 合成多肽的活性分析
• 3.3.9 经验证后表位的氨基酸分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 虾过敏原与其他甲壳类过敏原的同源性分析
• 3.4.2 Pen a 1 过敏原蛋白的二级结构分析
• 3.4.3 Pen a 1 的氨基酸序列性质分析
• 3.4.3.1 亲疏水性分析
• 3.4.3.2 Pen a 1 溶剂可及性分析
• 3.4.3.3 Pen a1 可塑性分析
• 3.4.3.4 Pen a1 抗原指数分析
• 3.4.4 Pen a1 表位的在线工具预测
• 3.4.5 Pen a 1 表位的综合分析预测
• 3.4.6 Pen a 1 预测表位区域的序列比对
• 3.4.7 合成线性多肽的准确度和纯度分析
• 3.4.8 合成表位多肽的二级结构分析
• 3.4.9 竞争性Dot-blot 方法对于合成多肽活性的初步验证
• 3.4.10 主要过敏原表位的氨基酸组成分析
• 3.5 小结
• 4 虾过敏原空间结构的模拟
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 搜索模板
• 4.3.2 模板的筛选
• 4.3.3 根据模板进行建模
• 4.3.4 结构稳定性分析和评估
• 4.3.5 结构优化
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 模板的检索
• 4.4.2 模板的筛选
• 4.4.3 Pen a 1 三维模型的构建
• 4.4.4 Pen a 1 三维模型的评估
• 4.4.4.1 原子平均势能和分子体系动力学分析
• 4.4.4.2 拉氏构象图分析
• 4.4.5 表位区域的空间定位
• 4.5 小结
• 5 虾过敏原关键氨基酸的初步筛选
• 5.1 引言
• 5.2 仪器与试剂
• 5.2.1 实验仪器
• 5.2.2 主要材料与试剂
• 5.2.3 溶液的配制
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 表位区域的序列比对
• 5.3.2 表位肽中突变氨基酸的确定
• 5.3.3 突变表位多肽活性的分析
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 表位区域的序列比对
• 5.4.2 表位肽中突变氨基酸的确定
• 5.4.3 突变表位多肽活性的分析
• 5.5 小结
• 6 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文