传染性支气管炎病毒番鸭分离株的鉴定及N基因片段序列分析

论文摘要

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。病毒血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大,主要症状为呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等。近年来,IB的流行呈上升趋势,尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎的发生,给养禽业造成巨大的经济损失。病毒基因组为线状、不分节段、单股正链RNA,全长27.6kb,主要结构蛋白为纤突（S）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白,其中唯一位于膜内的由409个氨基酸组成的N蛋白,能特异性结合到引导RNA上,参与病毒RNA的复制、转录和翻译。以往,人们对IBV的研究主要集中在S1基因上,认为N基因在IBV的进化中高度保守;但近年研究发现,N基因也存在广泛的变异,并且这些变异分布于抗原表位和相关功能区域,预示不同毒株N基因变异可能导致病毒的某些生物特性发生改变。2008年12月我省莆田某种番鸭养殖场发生疾病:产蛋高峰期番鸭产蛋锐减,产蛋率从85%降低到30%40%,经两个月后逐渐恢复至60%,蛋质量下降,软壳蛋、畸形蛋增多,孵化率降低,病番鸭伴有一过性呼吸道症状,死亡率极低,剖检发病番鸭发现卵泡膜充血,其它实质器官无明显病变。取病番鸭卵巢组织进行病毒分离（毒株命名为PTFY株）,经鸡胚传代、理化特性试验、血凝试验、电镜观察、测序对比等鉴定PTFY株为IBV,结果如下:1、经9日龄SPF鸡胚传代,第5代开始出现侏儒胚、尿囊腔有大量白色絮状物沉积。理化特性试验,发现经氯仿、乙醚、去氧胆酸钠处理后的病毒,其感染力降低。经电镜负染观察发现病毒粒子直径为100nm,有囊膜,略呈球形,囊膜上可见花瓣样纤突,符合冠状病毒特性。2、取第5代尿囊液,用1%胰酶处理不同时间后测血凝价,发现血凝价随胰酶消化时间的延长而提高,4h达到最高,随后处于稳定状态;取不同培养时间（36h、48h、72h、96h、120h）鸡胚尿囊液,用1%胰酶处理后测血凝价,发现血凝价随着培养时间的延长而增加。3、将病毒液通过点眼、滴鼻感染SPF雏鸡,第3天开始出现呼吸困难、精神萎顿等临床症状。但是剖检并未有明显的特征病变。对照组无异常。后取肾脏组织经RT-PCR检测,证明其有IBV。4、将PTFY株进行新城疫病毒干扰试验,发现PTFY株对新城疫病毒的复制有抑制作用。5、取第5代尿囊液用气管环培养物进行病毒感染力测定,得出其TOC-ID50=10-5.413/0.1ml;将PTFY株与本实验室保存的PT株进行血清中和试验,得知两者抗原相关性低。6、参考GenBank中IBV毒株（GenBank:DQ001338.1）,设计引物,经反转录聚合酶链式反应（Reverse-translation polymerase-chain reaction,RT-PCR）扩增得到600bp片段产物,通过测序比对发现与美国呼吸型强毒株Mass41的同源性为97.3%,与山东肾型毒株CK/CH/LSD/03I的同源性为99%,与H52的同源性为97.8%,证实PTFY株为IBV。7、用DNAstar、DNAman等分析软件,将PTFY分离株N基因片段（345945位）扩增产物序列与GenBank中14株国内外参考毒株进行核苷酸序列比较和同源性分析,绘制出核苷酸序列的系统进化树,得出核苷酸序列同源性、进化树中的分支地位与病毒亲嗜性、致病力没有必然的联系。本试验从番鸭卵巢中分离到一病毒株（命名PTFY）,后经鸡胚传代、理化特性研究、电镜观察、测序对比等鉴定为IBV,说明IBV能够感染水禽。可知IBV不仅对鸡、孔雀等陆生家禽有致病性,还对水禽（番鸭）具有感染性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 综述
• 1 禽传染性支气管炎
• 1.1 鸡传染性支气管炎概述
• 1.2 传染性支气管炎流行病学
• 2 禽传染性支气管炎病毒概述
• 2.1 病毒分类地位
• 2.2 病毒形态特征
• 2.3 病毒的理化性质
• 2.4 病毒的生物学活性
• 2.5 病毒培养及实验宿主系统
• 2.6 病毒基因组结构
• 2.7 病毒的结构蛋白及功能
• 2.8 IBV 合成机理
• 2.9 IBV 遗传变异机制及影响因素
• 第二部分 研究报告
• 1 试验材料与方法
• 1.1 病料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验动物
• 1.4 试验仪器设备
• 1.5 病料处理
• 1.6 细菌的分离
• 1.7 病毒的分离
• 1.8 病毒理化特性
• 1.9 病毒血凝试验
• 1.10 鸡胚致病性试验及动物回归试验
• 1.11 新城疫病毒干扰试验
• 1.12 病毒的电镜观察
• 50 的测定及血清中和试验'>1.13 TOC-ID₅₀的测定及血清中和试验
• 1.14 病毒核酸的RT-PCR
• 1.15 N 基因的克隆
• 1.16 序列测定及比较
• 2 试验结果
• 2.1 病毒分离
• 2.2 病毒的理化特性
• 2.2.1 对氯仿、乙醚敏、去氧胆酸钠敏感性试验
• 2.2.2 耐热性试验
• 2.3 血凝试验
• 2.3.1 不同消化时间相同代次血凝试验
• 2.3.2 相同消化时间不同代次血凝试验
• 2.4 鸡胚致病性和动物回归试验
• 2.5 新城疫病毒干扰试验
• 2.6 电镜负染观察
• 50 测定及血清中和试验'>2.7 TOC-ID₅₀测定及血清中和试验
• 50 测定'>2.7.1 TOC-ID₅₀测定
• 2.7.2 血清中和试验
• 2.8 病毒核酸的PT-PCR
• 2.9 重组质料的酶切鉴定
• 2.10 N 基因片段序列分析
• 2.10.1 N 基因片段序列对比
• 2.10.2 N 基因片段序列同源性比较
• 2.10.3 N 基因片段序列进化树分析
• 2.11 PTFY 株N 蛋白氨基酸序列比较分析
• 2.11.1 PTFY 株N 蛋白氨基酸组成
• 2.11.2 不同毒株的N 蛋白氨基酸序列对比
• 2.11.3 氨基酸疏水性比较
• 2.11.4 五个毒株核蛋白抗原位点比较分析
• 2.11.5 蛋白的空间结构
• 3 分析讨论
• 3.1 病毒的分离
• 3.2 血凝实验
• 3.2.1 IBV 血凝性
• 3.2.2 血凝性与感染关系
• 3.3 分离毒株在鸡胚上的增值特性
• 3.4 病毒培养宿主的选择
• 3.5 新城疫病毒干扰试验
• 3.6 PTFY 分离株的理化性质
• 3.7 血清交叉中和试验
• 3.8 病毒跨种传播探讨
• 3.9 N 基因核酸序列分析
• 3.9.1 PTFY 株N 蛋白核酸分析
• 3.9.2 基因重组对IBV 血清型的影响
• 3.9.3 N 基因遗传变异趋势
• 3.10 N 蛋白氨基酸序列比较分析
• 3.10.1 PTFY 分离株序列氨基酸组成
• 3.10.2 毒株疏水性分析
• 3.10.3 N 基因抗原位点分析
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 致谢