肠易激综合征肠粘膜屏障功能的研究

论文摘要

背景肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一组以排便后缓解或减轻的腹痛或腹部不适症状为主要症状，同时伴随有排便习惯及大便性状改变的功能性肠道疾病。根据大便性状的不同，RomeⅡ将IBS分为3个症状亚型，即腹泻型IBS，便秘型IBS及交替型IBS。IBS的发病机制目前尚未完全阐明，它是一种多因素疾病，其发病原因涉及精神心理因素，食物过敏，发病前的胃肠道感染病史等。最近的研究发现腹泻型IBS患者存在着小肠通透性增高的现象，这种增高的肠通透性从何而来以及是否与临床症状有关目前尚不清楚。尽管IBS患者在结肠镜下的表现及活检组织的苏木素-伊红染色是正常，但使用免疫组织化学染色方法却发现腹泻型IBS病人结肠和直肠粘膜中活化淋巴细胞的数量较正常人明显增多，这提示着部分腹泻型IBS病人存在着低度肠道慢性炎症和局部免疫系统的活化，也意味着这种持续存在的肠道低度炎症可能与某些腹泻型IBS患者的症状发生有关。正常情况下，肠上皮细胞间的连接复合体形成粘膜与粘膜下之间的一道具有高度选择性的机械屏障，允许小分子物质通过，阻止大分子抗原物质穿过上皮层到达粘膜下促发免疫反应。紧密连接位于该连接复合体的顶端，对上皮细胞间机械屏障的形成和功能起着至关重要的作用。大量的体内和体外研究已经证实免疫系统活化具有破坏肠上皮细胞间机械屏障及紧密连接结构的作用。炎症状态可以破坏肠上皮细胞的机械屏障功能，增加肠道通透性，如急性胃肠炎、乳糜泻、非特异性炎症性肠病时常伴随有肠道通透性增高等。因此，腹泻型IBS患者的肠道通透性增高可能与肠道低度炎症有关。紧密连接结构由多种蛋白组成，其中occludin蛋白和ZO-1（zonula occludens-1）蛋白对维持其正常的结构和功能起着至关重要的作用。目前尚未有关于腹泻型IBS病人中连接复合体及主要紧密连接分子（ZO-1和occludin）有无异常的研究。IBS的症状具有易反复、迁延性的特点，临床治疗比较困难，因此，选择具有减轻炎症及恢复肠粘膜机械屏障功能作用的制剂来治疗腹泻型IBS可能会有比较理想的临床疗效。益生菌即是符合这样要求的一种制剂，它能与肠上皮细胞相互作用从而发挥恢复其机械屏障功能和抗炎效应。益生菌是指当摄入一定数量，以活菌状态到达胃肠道，能够对宿主的某些疾病状态起治疗或预防作用的单一或特定微生物的混合物。目前研究得最多的益生菌是乳酸菌（lactic acidbacteria）。临床研究证实某些乳酸菌，如用于发酵型食品的Lactobacillusacidophilus，单用即能明显缓解IBS腹痛、腹泻症状。Bifidobacterium infantis35624除了能减轻IBS的腹痛、腹胀症状，还能平衡IBS患者的外周血白介素-10（interleukin，IL）／IL-12比例失调。体外研究已经证实活性Lactobacillusacidophilus或Streptococcus thermophilus具有维持人肠上皮细胞Caco-2机械屏障完整性的作用。但活性乳酸菌能否改善腹泻型IBS患者的肠道通透性及临床症状，目前尚无此方面的研究报告。活性乳酸菌的保存条件要求高（低温、避光），且因其的发酵作用能改变食物的口感和质地等原因致使它不能添加至大多数食物中，所以，活性乳酸菌目前只能在少数发酵型食品如酸牛乳（fermented milk）和yogurt中应用。因此，酸牛乳和yogurt是一种比较理想的研究活性乳酸菌在人体作用的制剂。目的1．观察腹泻型IBS患者的小肠和结肠粘膜屏障功能改变，并探讨其与结肠炎症及临床症状之间的关系；观察腹泻型IBS患者的上皮细胞间连接复合体及主要紧密连接分子（ZO-1和occludin）的mRNA表达水平及蛋白表达水平和分布。2．观察短期活性乳酸菌治疗对腹泻型IBS患者的肠粘膜屏障功能及症状的临床疗效。3．观察热灭活乳酸菌混合物（L．bulgaricus，S.thermophilus和L．acidophilus）能否拮抗炎症介质对人结肠癌上皮细胞Caco-2上皮屏障功能及紧密连接分子ZO-1和occludin的损害作用；观察热灭活乳酸菌能否拮抗炎症介质所诱导的一氧化氮（nitric oxide，NO）产量增加和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）mRNA表达升高。方法1．30例符合RomeⅡ腹泻型IBS诊断标准的患者参加该研究，同时入组12例无消化道症状且结肠镜检查正常的健康志愿者为正常对照组。研究对象的肠粘膜屏障功能评价指标为肠道通透性。采用三联糖分子探针法检测受试者的小肠和结肠通透性，检查前受试者空腹并排空膀胱，服用100ml的测试液，含有10g乳果糖、5g甘露醇和5g三氯蔗糖（sucralose），然后连续收集受试者5h和24h的尿液，并记录5h和24h的总尿量。采用气相色谱法检测尿液中糖分子的浓度。小肠通透性以5h尿中乳果糖／甘露醇排泄率比值表示，结肠通透性以24h尿中三氯蔗糖的总含量表示（mg）。所有的研究对象均行结肠镜检查，在直乙结肠交界处取活检组织5块，其中1块用于透射电镜下观察肠上皮细胞间连接复合体，2块用于实时荧光定量多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测紧密连接蛋白（ZO-1，occludin）的转录水平表达情况。1块用于冰冻切片免疫组织化学方法评价ZO-1和occludin蛋白的表达水平和分布，1块用于石腊切片免疫组织化学CD3、CD25染色，CD3+细胞为淋巴细胞、CD25+细胞为活化淋巴细胞，显微镜下计数CD3+细胞和CD25+细胞数量以评价结肠炎症严重程度。IBS症状总积分为胃肠道症状自评量表（Gastrointestinal symptom rating scale，GSRS）中腹痛和腹泻症状亚型的总积分。为避免结肠镜前的肠道准备影响肠道通透性检查的结果，所有受试者均先进行肠道通透性检查，再行结肠镜检查。2．采发用随机单盲安慰剂对照设计，入组30例符合RomeⅡ诊断标准的腹泻型IBS患者，按1：1的比例随机分入益生菌组和安慰剂组，益生菌组服用酸牛乳（AB100，中国光明）190g，每天两次，餐前半小时服用，安慰剂组服用配置型含乳饮料（中国光明）200ml，每天两次，餐前半小时服用。疗程为4周。酸牛乳含有4种乳酸菌，为S.thermophilus，L．bulgaricus，L．acidophilus和Bifidobacterium，而含乳饮料与酸牛乳颜色、粘稠度及口感相似但不含有任何细菌。研究者在试验前对AB100进行取样，菌落培养，以确定该酸牛乳中含有的乳酸菌均有活性。酸牛乳保存在4℃冰箱，含乳饮料可常温置放。患者于治疗前和治疗4周结束分别评价临床症状及肠粘膜屏障功能。受试者肠粘膜屏障功能的评价指标为肠道通透性。采用三联糖分子探针法检测受试者的小肠和结肠通透性，检查前受试者空腹并排空膀胱，服用100ml的测试液，含有10g乳果糖、5g甘露醇和5g三氯蔗糖（sucralose），然后连续收集受试者5h和24h的尿液，并记录5h和24h的总尿量。采用气相色谱法检测尿液中糖分子的浓度。小肠通透性以5h尿中乳果糖／甘露醇排泄率比值表示，结肠通透性以24h尿中三氯蔗糖的总含量（mg）表示。本试验采用胃肠症状自评量表（Gastrointestinal SymptomRating Scale，GSRS）评价症状，记录IBS症状的总积分为该量表中腹痛和腹泻亚型积分的总和，该评分每次至少由两个研究者评估，并都同意该评分结果。同时发给患者统一编制的日记卡，采用100mm视觉模拟评分（visual analoguescale，VAS），记录每天下腹痛，腹胀和胀气感症状的严重程度。同时入组12例无消化道症状的健康正常人设为正常对照组。主要疗效指标为治疗4周结束时肠道通透性增高的患者比例及其中位数的改善情况；次要疗效指标为GSRS量表中IBS症状总积分和日记中肠道症状的每周VAS积分的改善情况。3．L．bulgaricus，S.thermophilus和L．acidophilus用于该研究。乳酸菌热灭活的条件是为65℃，1 h。混合后的乳酸菌（mixture of lactic acid bacteria，Mix-LAB）浓度为S.Thermophilus，L．Bulgaricus和L．Acidophilus的总菌体细胞浓度，三者的比例为1：1：1。选择人结肠上皮细胞Caco-2构建体外屏障模型，Caco-2细胞生长至融合后的14-21天后，改用无血清无抗生素的DMEM培养液继续培养24h，使细胞获得同步生长并处于静止期，随后进行干预。细胞干预时所用的培养液为无血清无抗生素的DMEM。Cytomix为炎症介质混合物，包含10 ng／ml干扰素γ，10 ng／ml肿瘤坏死因子α和1 ng／ml白介素1β。Caco-2与培养液+cytomix，或与培养液+cytomix 109／ml浓度的热灭活Mix-LAB共培养72h，以不加任何刺激物的DMEM培养液为正常空白对照。72h干预结束后用细胞刮刀收集不同干预组的细胞，做好标记，分别提取细胞总蛋白和总RNA，用于Westernblot和实时荧光定量PCR检测紧密连接分子（ZO-1和occludin）的蛋白和mRNA表达水平；细胞爬片免疫细胞化学染色观察不同干预条件下ZO-1和occludin蛋白表达部位的变化；并采用硝酸还原酶法检测培养液上清中NO产量。细胞机械屏障功能用Caco-2对小分子量物质荧光素钠（MW 376 Da）的通透性来表达。在检测上皮细胞通透性时，Caco-2生长在Transwell小室中，在干预24h、48h、72h后分别测通透性，为观察有无剂量依赖性，107、108、109／ml浓度的热灭活Mix-LAB分别用于该研究。通透性用清除率表示，按以下公式计算：C=[L]×v／（[A]×A×t）（nl／cm2／h）。式中，[L]为底室荧光素钠浓度，V为底室液体的容积，[A]为顶室荧光素钠浓度（0．2g/ml），t为时间（h），A是滤膜面积（cm2）。结果1．小肠通透性的正常上限为5h尿中乳果糖／甘露醇排泄率比值为0．025，结肠通透性的正常上限为24h尿中三氯蔗糖的总含量为42．1mg，为该研究中正常人数据的P95。腹泻型IBS患者中小肠和结肠通透性增高的患者比例分别为60％（18／30），53．3％（16／30）。患者的小肠和结肠通透性均较正常人明显升高（0．0377（0．026）versus 0．0182（0．006），P=0．002；44．3（43．7）versus 31．36（10．7），P=0．028）。Spearman相关分析显示小肠和结肠通透性与结肠粘膜免疫细胞数量无明显相关性，表现为小肠和结肠通透性与固有膜CD3+细胞数量（r=-0．325，P=0．08；r=-0．056，P=0．768），与CD25+细胞积分（r=0．302，P=0．105；r=-0．242，P=0．197）及与上皮间淋巴细胞数量（r=-0．07，P=0．714；r=-0．143，P=0．450）。小肠和结肠通透性与GSRS量表中IBS总症状积分均无明显相关（r=0．153，P=0．250；r=0．025，P=0．895），与每天大便次数亦无明显相关性（r=0．01，P=0．941；r=0．106，P=0．579）。实时荧光定量PCR分析显示，腹泻型IBS患者的ZO-1和occludin mRNA相对表达量较正常对照组显著下降（0．573（0．734）versus 1．016（0．47），P=0．038；0．393（1．32）versus 0．856（1．46），P=0．027）；腹泻型IBS患者结肠的ZO-1蛋白染色呈强阳性者有9例，阳性者有8例，弱阳性者13例，无一例为阴性；occludin蛋白染色强阳性的患者有6例，阳性者有7例，弱阳性者17例，无一例为阴性。ZO-1和occludin蛋白染色强度的患者分布均与正常人群有显著差异（卡方值=9．905，P=0．042；卡方值=13．238，P=0．010）。但ZO-1和occludin蛋白染色未见分布异常。透射电镜检查示部分病人（n=10）结肠上皮细胞间连接复合体染色较正常组浅，且不连续，但连接复合体间隙并不增宽。2．益生菌治疗4周后，患者的小肠通透性中位数较治疗前显著下降，（0．0228（0．020）versus 0．0380（0．024），P=0．004），小肠通透性增高的患者比例较治疗前显著下降（28．6％versus 64．3％，P=0．023）；结肠通透性的中位数与治疗前相比并无显著改变（47．1（51．22）versus 50．0（31．48），P=0．140），结肠通透性增高的患者比例无显著改变（57．1％versus 50．0％，P=0．705）。治疗4周后，安慰剂组小肠和结肠通透性的中位数均较治疗前无明显改变，而且小肠和结肠通透性增高的患者比例与治疗前相比无明显变化。治疗4周结束时，益生菌组的IBS症状总积分较治疗前显著下降（7．64±1．24 versus 9．62±1．05，P<0．001），安慰剂组则无明显改善（9．18±1．48 versus 9．60±1．16，P=0．061）。症状的每周VAS数据统计分析显示4周的益生菌治疗可显著改善下腹痛症状（37．76±5．87 versus30．11±7．71，P<0．001）和胀气感症状（36．61±6．04 versus 32．50±8．11，P=0．01），但对腹胀症状无改善（3 1．67±4．65 versus 32．10±4．53，P=0．897）；安慰剂治疗4周不能改善这些肠道症状。益生菌治疗4周后，Pearson相关性分析显示治疗前后小肠通透性的变化值与GSRS量表中IBS症状总积分的变化值无明显相关（r=0．343，P=0．229），与腹痛症状变化指数无明显相关性（r=0．385，P=0．202）。整个试验过程中无不良反应出现。3．Caco-2细胞与cytomix共同孵育24h后，对荧光素钠的通透性即开始增加（56．32±5．04），48h时为76．03±5．08，72h时为85．08±3．11，均较正常对照组同时段的清除率显著增高（P<0．001）。在培养液中加入热灭活的Mix-LAB（107／ml）后并不能改善24h、48h、72h时cytomix诱导的Caco-2细胞对荧光素钠的高通透性。然而，热灭活Mix-LAB浓度为108／ml和109／ml时能显著改善cytomix所诱导的Caco-2对荧光素钠高通透性，其中108／ml的这一效应最早在共孵育48h后出现（52．34±1．85 versus 76．03±5．08，P<0．001），109／ml Mix-LAB的这一效应则最早在共孵育24h即可出现（26．4±2．56 versus 56．32±5．04，P<0．001）。Caco-2与cytomix孵育72h后，ZO-1和occludin的mRNA水平较正常对照组显著下降（0．065（0．072）versus 1．016（2．625），P<0．001；0．013（0．019）versus 0．908（1．672），P<0．001）；ZO-1和occludin的蛋白表达水平分别降至正常水平的27％，25％。热灭活Mix-LAB （109／ml）能使ZO-1和occludin的mRNA表达和蛋白表达水平接近正常。Cytomix使ZO-1和occludin的特异性抗体染色变浅且不连续，热灭活Mix-LAB（109／ml）作用72h后可使ZO-1和occludin的染色恢复呈强且连续。Cytomix作用72h能诱导Caco-2细胞的iNOS mRNA相对表达水平升高（25．01（47．2）versus 1．22（2．0），P<0．001），但若在培养液中加入热灭活Mix-LAB（109／ml）后iNOS mRNA的相对表达水平较cytomix单独作用时显著下降（2．49（4．02）versus 25．01（47．2），P<0．001），与正常对照组的表达水平相似（P>0．05）。同样地，cytomix可诱导培养液上清中NO的产量增高（10．66±2．03versus 3．38±1.31，P<0．001），该作用能被热灭活Mix-LAB（109／ml）阻止（4．02±1．19versus 10．66±2．03，P<0．001），使NO产量接近正常水平（P=0．391）。结论1．腹泻型IBS患者存在着小肠和结肠粘膜机械屏障功能不足，与结肠炎症程度和临床症状均无明显相关。2．部分腹泻型IBS患者的结肠上皮细胞间连接复合体异常。部分腹泻型IBS患者结肠粘膜的主要紧密连接分子（ZO-1和occludin）的转录表达水平及蛋白表达水平下降，但ZO-1和occludin蛋白的分布部位并无改变。3．短期活性乳酸菌治疗可显著改善腹泻型IBS患者的小肠粘膜屏障功能和临床症状，但不能改善结肠粘膜屏障功能。活性乳酸菌治疗后小肠通透性的改善与IBS症状的改善无明显相关性，提示小肠通透性增加可能与腹泻型IBS症状的发生无关，活性乳酸菌改善IBS症状和小肠屏障功能可能是通过不同的作用机制。4．热灭活乳酸菌混合物对炎症介质引起的上皮细胞屏障功能障碍具有保护作用，其作用呈剂量依赖性。改善细胞通透性的作用通过改变紧密连接分子（ZO-1和occludin）基因、蛋白表达水平和蛋白分布。其作用机制与热灭活乳酸菌抑制炎症介质诱导的iNOS基因表达及减少NO产量增加有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 腹泻型肠易激综合征肠粘膜屏障功能的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图表
• 参考文献
• 第二部分 菌生菌治疗肠易激综合征肠粘膜屏障功能的临床研究
• 前言
• 研究对象和方法
• 结果
• 讨论
• 附图表
• 参考文献
• 第三部分 乳酸菌改善Caco-2细胞屏障功能障碍的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图表
• 参考文献
• 在读博士学位期间发表的论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文1
• 英文论文2