论文题目: 山羊痘病毒基因缺失转移载体及基因缺失突变毒株的构建
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 郭巍
导师: 相文华,薛飞
关键词: 羊痘病毒,山羊痘,基因,基因,基因缺失,突变株
文献来源: 东北农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 山羊痘和绵羊痘病(Goat and sheep pox disease)是由羊痘病毒(Capripoxvirus, CPV)感染山羊和绵羊等偶蹄动物引起的一种烈性传染病,病畜以发热、全身性起痘为典型特征。我国目前多使用山羊痘鸡胚化弱毒疫苗预防羊痘病,对羊痘病毒很少有分子病毒学方面的研究。 本实验的目的是以我国广泛使用的山羊痘弱毒疫苗株(GTPV-TY)为模板,通过基因重组等方法构建新型山羊痘病毒基因缺失疫苗。主要进行了以下工作:(1)根据GENBANK公布的羊痘病毒基因组序列设计引物,利用PCR克隆GTPV-TY株TK基因和P32基因;(2)以TK基因或P32基因为目的基因,构建基因缺失转移载体用于同源重组;(3)将LacZ基因表达盒插入TK基因缺失转移载体,筛选TK基因缺失的GTPV-TY突变株。 胸苷激酶基因(TK)是痘病毒的毒力基因之一,而且是病毒生长和复制非必需的基因。试验中首先用PCR方法克隆了GTPV-TY的TK基因,TK基因ORF大小为534bp,编码178个氨基酸,TK的N端具有ATP结合结构域,与其它毒株的TK基因的核苷酸序列比较显示CPV各毒株TK基因的同源性大于96%,保守性很高。为了构建TK基因缺失转移载体,设计了两对引物PRETK1/PRETK2和BACTK1/ACTK2分别扩增得到长度约1kb的TK基因同源重组前臂和同源重组后臂,分别插入到pGEM-T easy载体;通过双酶切的方法鉴定序列的插入方向后,将两段重组臂按照它们在基因组中的排列顺序重新连接起来,构建成pdTK转移载体。pdTK载体人为去除了TK基因ORF内部337bp的核苷酸序列,并且改变了N端ATP结合结构域的氨基酸组成,完全消除了突变株表达TK活性的可能,而且缺失部分不会影响与TK基因相邻的基因结构。两条同源重组臂的连接位置引入了SmaI酶切位点,可以作为外源基因的插入位点。 P32基因是痘苗病毒(VV)H3L基因的同源物,是病毒的囊膜蛋白,根据GENBANK公布的羊痘病毒基因组序列设计引物,用PCR方法克隆了GTPV-TY的P32基因,P32基因ORF大小为969bp,编码323个氨基酸,与其它CPV毒株P32基因的同源性在97%以上,是高度保守的基因。参照构建pdTK转移载体的方法,构建了pdP32转移载体,人为除去了P32基因包括起始密码子在内的525bp的核苷酸序列,完全消除了突变株表达P32蛋白的可能,而且缺失部分不会影响与P32基因相邻的基因结构。同源重组臂之间也带有SmaI酶切位点,以便插入外源基因。 重组病毒的筛选标记为自行构建的LacZ基因表达盒,其中LacZ片段通过限制性内切酶酶切从质粒pcDNA 3.1/His/LacZ中获得,Pcmv启动子序列通过PCR方法从质粒pcDNA 5_TO中获得;插入pGEM-T easy载体,构建成LacZ基因表达盒pCMV-LacZ,从中切下CMV-LacZ片段插入pdTK,构建成pdTK/LacZ质粒。将pdTK/LacZ利用脂质体方法转染已经感染GTPV-TY毒的羊胎皮肤细胞,当大部分细胞出现病变时,收获病毒,再用X-gal筛选蓝色蚀斑连续纯化4代,得到重组病毒TK~-/LacZ~+GTPV-TY突变株,重组病毒经电子显微镜检验,形态与正常病毒相同,提取重组病毒DNA并使用LacZ基因特异引物Id1/Id2进行PCR扩增,可以得到0.4kb的特异片段,证明重组病毒构建成功。
论文目录:
摘要
英文摘要
1 引言
1．1 CPV的研究概况
1．1．1 羊痘病的发病概况
1．1．2 CPV的基本特征
1．1．3 CPV的基因组结构
1．1．4 CPV各毒株之间的关系
1．1．5 CPV的诊断方法
1．2 与 CPV毒力相关的蛋白及其功能
1．2．1 核苷酸还原酶
1．2．2 胸腺嘧啶核苷激酶
1．2．3 囊膜蛋白
1．3 CPV疫苗的研究概况
1．3．1 CPV传统疫苗
1．3．2 亚单位疫苗
1．3．3 新型CPV基因缺失疫苗
1．4 基因缺失CPV重组病毒的构建及筛选策略
1．4．1 构建重组 CPV的基本原理
1．4．2 转移载体的基本元件
1．5 研究的目的和意义
2 材料和方法
2．1 材料
2．1．1 病毒与细胞
2．1．2 质粒与菌种
2．1．3 基因组信息来源
2．1．4 引物
2．1．5 细胞培养基的制备
2．1．6 试剂
2．1．7 主要仪器
2．2 实验方法
2．2．1 羊胎皮肤细胞的制备
2．2．2 GTPV-TY株的培养与病毒 DNA的提取
2．2．3 TK基因的克隆和序列测定
2．2．4 P32基因的克隆和序列测定
2．2．5 LacZ基因转移载体pCMV-LacZ的构建
2．2．6 带有LacZ基因的GTPV TK基因缺失载体的构建
2．2．7 带有LacZ基因的GTPV P32基因缺失载体的构建
2．2．8 表达LacZ基因的TK~-GTPV-TY毒株的筛选和鉴定
3 结果
3．1 GTPV-TY株的培养
3．2 GTPV-TY株TK基因的序列测定分析
3．2．1 GTPV-TY株TK基因的克隆
3．2．2 GTPV-TY株TK基因序列测定
3．2．3 TK基因同源性比较
3．3 GTPV-TY株P32基因的序列测定分析
3．3．1 GTPV-TY株P32基因的克隆
3．3．2 GTPV-TY株P32基因序列测定
3．3．3 P32基因同源性比较
3．4 LacZ基因转移载体的构建
3．4．1 Pcmv序列的克隆
3．4．2 重组载体pCMV-LacZ的构建
3．5 带有LacZ基因的GTPV TK基因缺失载体的构建
3．5．1 重组臂的克隆
3．5．2 TK基因缺失载体pdTK的构建
3．5．3 表达LacZ基因的重组载体的构建
3．6 带有LacZ基因的GTPV P32基因缺失载体的构建
3．6．1 重组臂的克隆
3．6．2 P32基因缺失载体pdP32的构建
3．6．3 表达LacZ基因的重组载体的构建
3．7 表达LacZ基因的GTPV TK~-毒株的筛选和鉴定
3．7．1 病毒的筛选和纯化
3．7．2 重组病毒的PCR鉴定
4 讨论
4．1 GTPV-TY株的培养
4．2 GTPV-TY株的TK基因
4．3 TK基因缺失转移载体的构建
4．4 GTPV-TY株的P32基因
4．5 P32基因缺失转移载体的构建
4．6 TK基因缺失GTPV-TY重组病毒的构建和筛选
5 结论
致谢
参考文献
附录
附录A 本文使用的缩写
附录B 本实验获得的GTPV-TY株TK基因序列
附录C GTPV-TY TK基因同其它痘病毒TK基因的核苷酸序列比较
附录D GTPV-TY TK基因同其它痘病毒TK基因的氨基酸序列比较
附录E 本实验获得的GTPV-TY株P32基因序列
附录F GTPV-TY P32基因与其它痘病毒H3L基因的核苷酸序列比较
附录G GTPV-TY P32基因与其它痘病毒H3L基因的氨基酸序列比较
附录H pCMV测序结果
攻读学位期间发表的学术论文
发布时间: 2005-10-31
参考文献
- [1].猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究[D]. 何启盖.华中农业大学2000
- [2].重组杆状病毒作为一种新型的基因治疗载体的研究[D]. 潘永飞.华中农业大学2009
- [3].牛传染性鼻气管炎重组疫苗的基础研究[D]. 李继昌.东北农业大学2002
- [4].重组胶原样凝集素的体外抗 PRRSV 活性研究及 PRRSV-GEM 纯化技术的建立[D]. 李兰.中国农业大学2016
相关论文
- [1].山羊痘病毒某些生物学特性及其主要结构蛋白P32基因的研究[D]. 程振涛.贵州大学2009
- [2].伪狂犬病病毒上海株gE～-/gI～-/GFP～+/LacZ～+缺失株的构建及其免疫原性初步研究[D]. 姜焱.南京农业大学2002
- [3].猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究[D]. 何启盖.华中农业大学2000
- [4].伪狂犬病病毒主要毒力基因功能的研究[D]. 阳爱国.四川农业大学2005
- [5].猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 周艳君.东北农业大学2005
- [6].猪圆环病毒Ⅰ型、Ⅱ型全基因克隆及其基因交换重组的研究[D]. 朱玲.四川农业大学2005
- [7].表达亚洲1型口蹄疫病毒P1-2A3C基因的山羊痘病毒弱毒株构建及其复制非必需区筛选[D]. 张强.中国农业科学院2007
- [8].表达FMDV vp1基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究[D]. 王芳.中国农业科学院2007
- [9].表达FMDV vp1基因和山羊γ-干扰素基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究[D]. 海岗.中国农业科学院2008
- [10].山羊痘病毒基因缺失毒株及DNA疫苗的构建、鉴定和实验免疫[D]. 郑敏.吉林大学2008