抗真菌农用抗生素KA08的研究

论文摘要

本文针对近年来烟草生产上危害严重的烟草赤星病（Alternaria alternata（Freis）Keissler）,筛选获得了多株具有自主知识产权的拮抗链霉菌,并对具有优良特性的拮抗菌进行了分类鉴定、发酵条件优化、抗菌物质的分离纯化、抑菌防病机理及温室盆栽防效和安全性测定等方面的系统研究,开发出了一种极富研究和应用价值,且性质显著不同于多氧霉素的广谱农用抗生素KA08,对解决生产上有效防治链格孢属真菌病害的生防制剂品种单一、病原菌对多氧霉素的耐药性等问题,具有重要意义。研究结果如下:1、从采自辽宁、黑龙江、河北、山西等地的36份土样中分离到371株链霉菌。以烟草赤星病菌为靶标,利用活体对峙拮抗、发酵液抑菌活性测定和离体叶片防效试验相结合的多重筛选法,得到4株抑菌效果明显、抑菌谱较广且效果稳定的拮抗链霉菌:菌株182-2、163、88和127。拮抗菌发酵液理化性质测定表明:4菌株对温度、紫外线、自然光、酸碱的耐受性,发酵液的耐贮性和菌株的遗传特性虽有差异,但均较为稳定。其中菌株182-2显示出了良好的抑菌防病效果和优良的稳定性,有开发应用价值。2、采用经典分类和分子分类相结合的方法,对菌株182-2和菌株163进行了分类鉴定,明确了两菌株的分类地位,菌株182-2为链霉菌属可可链霉菌辽宁变种（Streptomyces cacaoi var.liaoningensis）,属灰褐类群;菌株163为链霉菌属细黄链霉菌辽宁变种（Streptomyces microflavus var.liaoningensis）,属粉红孢类群,并首次报道了细黄链霉菌对烟草赤星病菌的拮抗作用。3、通过培养基优化设计,获得了菌株182-2的次生代谢产物抗生素KA08的最佳发酵培养基配方:可溶性淀粉100g,花生饼粉24.0 g,酵母粉2.0 g,NH4NO4 2.0 g,CaCO32.7g,NaCl 2.7 g,水1000ml,pH7.2。抗生素KA08摇床发酵的最佳条件为:制备种子液的菌种种龄为斜面培养5d,接种量4.5%（种子液浓度108cfu/ml）,初始pH7.0,装液量40ml/三角瓶（250ml）,发酵温度28℃,发酵时间5d。对代谢过程中菌体浓度、可溶性糖、pH变化的检测结果表明:抗生素KA08来自能量代谢所用的基质,但其形成是在与初级代谢分开的次级代谢中。同时,抗生素产生和菌丝体生长有各自的最适pH,应分别加以严格控制才能优化发酵过程。4、通过捷克Doskochilova 8溶剂系统及pH纸层析证明:抗生素KA08为一类碱性水溶性抗生素,含有多个活性组分;Betina溶媒系统纸层析证明:KA08极性大,极易溶于水,且随溶剂极性的减小,溶解度降低。分析纸电泳试验中各组分的移动距离和方向,可知抗生素KA08含有多个强碱或弱碱性活性组分,属于链霉素型或放线菌素型。根据上述性质,在活性追踪下,采用草酸酸化、丙酮沉淀、活性炭吸附、大孔树脂富集、离子交换柱层析和Pharmadex LH20柱层析精制,以及二次薄层层析分离,对抗生素KA08进行了分离纯化,得到一个抗菌活性较高的组分Ha,四个活性较弱的组分a、c、d和Be。经HPLC纯度检测,组分Ha纯度较低,其两个主要成分的含量分别为62.90%和17.53%;组分a、c、d和Be的纯度分别为97.53%、98.79%、97.64%和96.06%,达到了结构测定的标准。紫外和红外谱图分析表明:组分a、c、d为氨基糖苷类物质,组分Be则更接近于核苷类物质的特点。官能团反应显示:组分Be和d含有醛基和不饱和键;组分a含有氨基酸、肽类或蛋白质结构;组分c含有不饱和键,及肽类或蛋白质结构。液质联用测定表明:组分c是分子量为269.0的小分子物质。总体分析:抗生素KA08不同于生产上广泛使用的可可链霉菌阿索变种产生的多氧霉素。5、抑菌防病机理研究表明:抗生素KA08能显著抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发,并对菌丝和孢子萌发后的芽管有明显致畸作用。抗生试验表明:KA08对赤星病菌主要起抑菌作用,杀菌作用很弱或基本无杀菌效果。抑菌机理研究发现:该物质能导致菌丝体内电解质泄漏,同时,细胞膜上麦角甾醇的含量显著降低,菌丝内和培养液中脂质过氧化产物-丙二醛的含量明显升高,证明其作用位点在病菌细胞膜上。它还可显著抑制菌丝体内蛋白质的含量,但不能通过产生几丁质酶对菌丝细胞壁中的几丁质产生影响。抗生素KA08处理能诱导烟草防御酶系中POD、PPO、PAL、SOD、CAT活性的提高并在一定程度上诱导产生PR蛋白。同时,KA08处理还可以诱导抗病信号通路中NPR1和PR1基因的表达,且PR1基因的表达有持效性,推测其可能启动了水杨酸防御反应信号传导途径。但ERF1基因的表达未被检测到。6、温室盆栽防效试验证明:采用保护性处理时,抗生素KA08溶液（2.0mg/ml）对烟草赤星病的防效为60.63%,同时,对具有伤口的叶片有轻微损害。安全性测定表明:KA08有较好的体内运转能力。当浓度≥2.0mg/ml,通过根部吸收时,KA08对烟草3～4叶期幼苗有轻微致萎作用;浓度＜2.0mg/ml时表现安全。当浓度≥2.0mg/ml,KA08叶面喷施对成株期植株没有影响,同时具有一定的刺激生长作用。总之,抗生素KA08是一种具有优良特性的农用抗生素,它的开发和应用符合现代植物保护的生防理念,具有重要的实际应用价值。

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前言

第一章抗真菌农用抗生素的研究进展

1 抗真菌农用抗生素的发展历史和概况

2 几种在生产上应用较广的抗真菌农用抗生素

3 农用抗生素的定义和特点

4 农用抗生素的作用机理

5 农用抗生素的筛选和获得

6 农用抗生素高产菌的选育

7 农用抗生素的分离纯化

8 抗生素的结构分析

9 农用抗生素的结构改造

10 抗真菌农用抗生素发展中存在的问题和展望

第二章烟草赤星病拮抗链霉菌的分离与多重筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 链霉菌的分离与纯化

2.2 拮抗链霉菌的筛选与获得

3 小结

第三章拮抗链霉菌发酵液抑菌效果及理化性质测定

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 拮抗菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制效果

2.2 发酵液理化性质的测定

3 小结

第四章拮抗链霉菌的鉴定

第一节形态学分类研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 气生菌丝和孢子丝的形态观察

2.2 培养特征观察

2.3 生理生化特性测定结果

2.4 菌种鉴定

3 小结

第二节分子分类鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的16S rDNA序列分析

2.2 拮抗菌株的系统发育分析

3 小结

第五章抗生素KA08发酵条件的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 发酵培养基主要营养成分的筛选

2.2 均匀设计优化发酵培养基

2.3 发酵条件对抗生素产量的影响

2.4 发酵过程中的代谢变化

3 小结

第六章抗生素KA08的初步提取及鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 抗生素的初步提取及活性测定

2.2 抗生素类型的鉴别

3 小结

第七章抗生素KA08的分离纯化及类型分析

第一节抗生素KA08的分离纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 抗生素KA08的初步提取

2.2 溶媒萃取法提取抗生素KA08

2.3 活性炭吸附法提取抗生素KA08

2.4 大孔树脂吸附法富集抗生素KA08

2.5 离子交换层析法分离纯化抗生素KA08

2.6 薄层层析法分离纯化抗生素KA08

2.7 Pharmadex LH20柱层析法精制各组分

2.8 分离物纯度的测定

3 小结

第二节抗生素KA08各组分类型的初步分析

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 官能团反应试验

2.2 各组分的紫外吸收光谱

2.3 各组分的红外吸收光谱

2.4 液质联用测定组分C的分子量

3 小结

第八章抗生素KA08防病机理研究

第一节抗生素KA08对病原菌的作用机理研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 抗生素KA08的抑菌效果和特性

2.2 抗生素KA08对赤星病菌的作用方式

2.3 抗生素KA08对赤星病菌的作用机理

3 小结

第二节抗生素KA08诱导烟草防卫反应的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 抗生素KA08对烟草防御酶系的影响

2.2 抗生素KA08对烟草病程相关蛋白的诱导作用

3 小结

第三节抗生素KA08诱导烟草抗病信号通路的初步研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 烟草总RNA的提取

2.2 目的基因的RT-PCR扩增

3 小结

第九章抗生素KA08的温室防效试验及安全性测定

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 菌株182-2发酵液的温室盆栽防病效果

2.2 抗生素KA08的温室盆栽防病效果

2.3 抗生素KA08对烟草幼苗的影响

2.4 抗生素KA08对烟草成株期植株的影响

3 小结

第十章结论与讨论

1 拮抗链霉菌的分离与多重筛选

2 拮抗链霉菌发酵液抑菌效果和理化性质测定

3 拮抗链霉菌的分类鉴定

4 抗生素KA08发酵条件的优化

5 抗生素KA08的初步提取及鉴定

6 抗生素KA08的分离纯化及类型分析

7 抗生素KA08的防病机理研究

8 抗生素KA08的温室防效试验及安全性测定

参考文献

致谢

攻读学位期间参与的课题和发表的文章

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