氯霉素残留快速检测胶体金试纸条的研究

论文摘要

本论文利用胶体金标记快速检测技术对氯霉素兽药残留快速检测方法进行了系统的研究。通过优化各项实验指标,建立了渗滤式（Flow-through）和层析式（Lateralflow）两种金标记免疫竞争快速筛选方法。以氯霉素与固相膜上的氯霉素-卵清蛋白（CAP-OVA）偶联物（即包被抗原）竞争结合金标记抗氯霉素多克隆抗体的方法,通过胶体金显色达到快速检测样品中氯霉素残留的目的。采用柠檬酸三钠还原氯金酸法,制备出粒径为20nm的胶体金,以此作为标记物标记抗氯霉素多克隆抗体,其中稳定1 mL胶体金所需抗体量约为18μg。Flow-through和Lateral-flow两种试纸条分别选用了硝酸纤维素（NC）膜和带底板的NC膜及吸收垫作为材料。将CAP-OVA偶联物和羊抗兔二抗按1μg/strip的和0.3μL/strip分别平行喷涂于NC膜上作为检测带和质控带,两条带间隔3mm。两种试纸条的最低检出限分别为0.8μg/L和1μg/L。以甲醇为提取溶剂,磷酸盐缓冲液PBS-0.05%Tween为基质掩蔽剂,对猪肉、鸡肉、鱼、虾、牛乳等样品进行了添加回收实验并通过酶联免疫吸附测定方法验证了两种快速检测方法的有效性。结果表明该方法的回收率为70.1%～112.5%,变异系数均小于10%,可成功地用于样品中氯霉素残留的快速检测。课题还进一步研究了几种氯霉素的结构类似物对其快速检测的干扰。除氯霉素琥珀酸钠外,甲砜霉素、氟甲砜霉素、氨卞西林和磺胺二甲基嘧啶在浓度为1000μg/L时均对氯霉素检测无明显干扰,说明了检测方法的高特异性。稳定性实验证明了Flowthrough金标试纸条在4℃下6个月内可保持检测结果的可靠性。该试纸条检测方法无需检测仪器,操作简单,快速,15 min内即可得出检测结果。实验结果稳定性高,可作为动物源性食品中氯霉素残留现场大量筛选的有效手段,也可为其他农兽药残留检测试纸条的研制提供借鉴。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 氯霉素
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 理化性质
• 1.1.3 氯霉素的药理学
• 1.1.4 氯霉素的毒副作用
• 1.1.5 氯霉素残留污染现状
• 1.1.6 氯霉素残留的检测技术
• 1.2 免疫胶体金技术及其应用
• 1.2.1 胶体金的发现
• 1.2.2 胶体金的性质及制备
• 1.2.3 胶体金标记蛋白质
• 1.2.4 免疫金的纯化
• 1.2.5 胶体金标记免疫检测技术及其应用
• 1.3 论文研究的目的及意义
• 1.4 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 载体膜
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗氯霉素多克隆抗体的处理
• 2.2.2 胶体金的制备
• 2.2.3 免疫金的制备
• 2.2.4 Flow-through金标记试纸条制备及检测步骤
• 2.2.5 Lateral-flow金标记试纸条制备及检测步骤
• 2.2.6 胶体金试纸条检测条件的优化
• 2.2.7 最低检出限的确定
• 2.2.8 试纸条检测方法的特异性
• 2.2.9 实际样品的分析
• 2.2.10 稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 抗氯霉素抗体的处理
• 3.1.1 抗体的纯化
• 3.1.2 抗体浓度的测定
• 3.1.3 抗体特异性
• 3.2 胶体金的制备与质量鉴定
• 3.2.1 胶体金的制备
• 3.2.2 胶体金的质量鉴定
• 3.3 胶体金与抗氯霉素多克隆抗体结合最适pH值的优化
• 3.4 抗体蛋白与胶体金结合的最佳比例的确定
• 3.4.1 目测法
• 3.4.2 分光光度计测定法
• 3.5 免疫金的质量鉴定
• 3.6 胶体金试纸条检测条件的优化
• 3.6.1 封闭液的优化
• 3.6.2 抗原包被量和免疫金稀释度的确定
• 3.6.3 免疫金与待测溶液最佳混合比例的确定
• 3.6.4 Lateral-flow金标记试纸条竞争时间的优化
• 3.7 最低检出限的确定
• 3.8 Flow-through和 Lateral-flow两种试纸条的比较
• 3.9 试纸条检测方法的特异性
• 3.10 实际样品的分析
• 3.10.1 样品中氯霉素的提取
• 3.10.2 实际样品基质影响的消除
• 3.10.3 添加回收实验
• 3.10.4 直接竞争酶联吸附测定法验证试纸条方法的有效性
• 3.11 稳定性实验
• 3.11.1 金标记抗体的稳定性
• 3.11.2 试纸条的稳定性
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢