青杨原生质体培养及叶片离体染色体加倍研究

论文摘要

杨树三倍体品种在林业生产中的突出表现证明,杨树多倍体育种具有巨大的挖掘潜力。细胞融合和体细胞染色体加倍是获得杨树多倍体种质的有效途径之一。本文以小青杨（Populus pseudo-simonii Kitag.）、北京杨（P.×beijingensis）为材料,在建立离体再生体系以及悬浮细胞培养体系的基础上,开展了原生质体分离、培养,以及施加秋水仙碱处理诱导小青杨离体叶片细胞染色体加倍研究,为细胞融合途径获得杨树体细胞杂种以及诱导离体组织染色体加倍途径创造杨树四倍体新种质打下了一定的基础。主要研究结果如下：1.研究了小青杨单芽茎段培养和愈伤组织再生技术,为进一步开展离体叶片细胞染色体加倍以及原生质体培养奠定了基础。小青杨单芽茎段在含NAA 0.05 mg/L的MS培养基中启动腋芽萌发,在含IBA0.5 mg/L的1/2MS培养基生根率达100%。用下胚轴和不带芽茎段为材料诱导愈伤组织,在MS附加2,4-D 2 mg/L, BA 0.05～0.1mg/L诱导效果最佳,愈伤组织颜色鲜黄,呈颗粒状；愈伤组织再分化的最适激素配比为BA1.0 mg/L和NAA 0.2mg/L,在此条件下8w即可分化出绿色不定芽。2.建立了小青杨悬浮细胞培养体系,为原生质体培养奠定了基础。小青杨茎段来源的愈伤组织建立的悬浮细胞系,在含2,4-D 2 mg/L、BA0.1 mg/L、ME 500 mg/L谷氨酰胺1500 mg/L和4%蔗糖的MS液体培养基中细胞分裂旺盛,生长特性呈S型曲线,继代周期为12d；长期在含高浓度2,4-D的培养基上培养不利于保持细胞分化能力,应根据悬浮细胞生长状态定期调整2,4-D和BA浓度；采用固体-液体轮回培养法,可以对培养物进行长期保存。3.研究建立了小青杨和北京杨叶肉和悬浮细胞原生质体分离技术体系。小青杨叶肉原生质体分离的最佳条件为将培养35 d的叶片置于含3.0%纤维素酶R-10、0.5%离析酶R-10、0.1%果胶酶Y-23和0.6 M甘露醇的混合酶液中酶解8 h,原生质体产量和活力分别达到2.44x 107个/g和78.7%。小青杨和北京杨悬浮细胞原生质体分离条件类似,适宜酶解液配比组合均为1.0%纤维素酶RS、0.5%离析酶R-10和0.6 M甘露醇,将培养6d的处于对数生长期的小青杨和北京杨下胚轴悬浮细胞分别酶解6h和4 h,可以获得产量和活力表现俱佳的原生质体。4.研究了小青杨和北京杨原生质体培养技术,获得了再生植株。原生质再生与原始材料来源密切相关,源于叶肉的小青杨原生质体培养甚至难以获得愈伤组织,而源于下胚轴悬浮细胞的小青杨、北京杨原生质体培养均可以获得再生植株。在小青杨和北京杨悬浮细胞原生质体培养中,以2×105个/mL的密度培养在附加2,4-D 2 mg/L、BA 0.2 mg/L和0.6 M葡萄糖的液体MMS培养基植板率最高；原生质体愈伤组织经1-2次增殖培养后可进行分化诱导,其中小青杨原生质体愈伤组织在含BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L的培养基上分化率最高,北京杨原生质体愈伤组织则在含BA 0.5mg/L和NAA 0.1 mg/L的培养基上分化率最高；原生质体再生植株均在含0.5 mg/LIBA的1/2MS培养基上生根良好。5.首次通过施加秋水仙碱处理诱导小青杨离体叶片细胞染色体加倍获得了四倍体植株。诱导小青杨叶片再生植株的最适激素组合是BA0.4 mg/L和NAA0.2 mg/L,叶片分化率达75.2%；将预培养6d的叶片在秋水仙碱浓度为30 mg/L的液体培养基中处理3d后,转入叶片再生培养基培养,嵌合体比率低,可以获得源于单细胞染色体加倍的四倍体,四倍体植株诱导率最高达14.6%。对经过5次继代的36株四倍体进行倍性检测,其倍性水平仍表现稳定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 1. 植物离体染色体加倍和原生质体培养研究进展
• 1.1 植物离体染色体加倍
• 1.1.1 离体染色体加倍影响因素
• 1.1.1.1 处理的材料
• 1.1.1.2 有丝分裂抑制剂
• 1.1.1.3 处理时间与处理浓度
• 1.1.1.4 处理方法
• 1.1.1.5 倍性检测
• 1.1.2 离体染色体加倍技术应用
• 1.2 植物原生质体分离与培养
• 1.2.1 植物原生质体的分离
• 1.2.1.1 原生质体分离的起始材料
• 1.2.1.2 植物原生质体的分离
• 1.2.1.3 植物原生质体的纯化
• 1.2.2 原生质体的培养
• 1.2.2.1 培养基
• 1.2.2.2 培养方法
• 1.2.3 原生质体技术的应用
• 1.3 研究思路和技术路线
• 2. 小青杨离体培养再生技术研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 小青杨无菌苗快繁体系的建立
• 2.1.3 小青杨愈伤组织的诱导
• 2.1.4 小青杨愈伤组织分化
• 2.1.5 小青杨悬浮细胞系的建立与保持
• 2.1.5.1 悬浮细胞系的建立
• 2.1.5.2 悬浮细胞系生长特性的测定
• 2.1.5.3 悬浮细胞系的保持和再生植株
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 小青杨无菌苗快繁体系的建立
• 2.2.2 小青杨愈伤组织的诱导和分化
• 2.2.2.1 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2.2 起始材料对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2.3 植物生长调节剂对愈伤组织分化的影响
• 2.2.3 小青杨悬浮细胞系的建立及其影响因素
• 2.2.3.1 悬浮体系的建立
• 2.2.3.2 起始接种量对悬浮细胞生长的影响
• 2.2.3.3 蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响
• 2.2.3.4 2,4-D浓度对悬浮细胞生长的影响
• 2.2.3.5 悬浮细胞系生长特性的测定
• 2.2.3.6 悬浮细胞系的保持和植株再生
• 2.3 讨论
• 2.3.1 愈伤组织诱导与分化
• 2.3.2 悬浮细胞系的建立
• 3. 小青杨原生质体培养与植株再生
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 小青杨叶肉原生质体分离
• 3.1.3 小青杨悬浮细胞原生质体分离
• 3.1.4 原生质体的产量与活力测定
• 3.1.5 小青杨原生质体培养
• 3.1.6 小青杨原生质体植株再生
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 小青杨叶肉原生质体分离
• 3.2.1.1 酶的浓度组合对原生质体分离的影响
• 3.2.1.2 甘露醇浓度对原生质体分离的影响
• 3.2.1.3 苗龄对原生质体分离的影响
• 3.2.1.4 酶解时间对原生质体分离的影响
• 3.2.1.5 预处理对原生质体分离的影响
• 3.2.2 小青杨悬浮细胞原生质体分离
• 3.2.2.1 继代培养时间对小青杨悬浮细胞原生质体分离的影响
• 3.2.2.2 酶液对小青杨悬浮细胞原生质体分离的影响
• 3.2.2.3 酶解时间对小青杨悬浮细胞原生质体分离的影响
• 3.2.3 小青杨原生质体培养
• 3.2.3.1 基本培养基和原生质体来源对原生质体培养的影响
• 3.2.3.2 培养方法和密度对原生质体培养的影响
• 3.2.4 小青杨原生质体植株再生
• 3.3 讨论
• 4. 北京杨原生质体培养与植株再生
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 北京杨原生质体分离
• 4.1.3 北京杨原生质体培养
• 4.1.4 北京杨原生质体植株再生
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 北京杨悬浮细胞原生质体分离
• 4.2.1.1 悬浮细胞继代培养时间对北京杨悬浮细胞原生质体分离的影响
• 4.2.1.2 酶解时间对北京杨悬浮细胞原生质体分离的影响
• 4.2.2 北京杨原生质体培养
• 4.2.2.1 培养方法和密度对北京杨原生质体培养的影响
• 4.2.2.2 碳源对北京杨原生质体培养的影响
• 4.2.2.3 植物生长调节剂对北京杨原生质体培养的影响
• 4.2.3 北京杨原生质体植株再生
• 4.3 讨论
• 5. 小青杨叶片体细胞染色体加倍
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 小青杨离体叶片再生
• 5.1.3 秋水仙碱处理小青杨无菌苗叶片诱导同源多倍体
• 5.1.4 倍性检测
• 5.1.5 叶片气孔大小和密度测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 小青杨离体叶片再生
• 5.2.1.1 植物生长调节剂对小青杨离体叶片再生的影响
• 5.2.1.2 离体再生过程中叶片形态变化
• 5.2.2 秋水仙碱处理小青杨无菌苗叶片诱导同源多倍体
• 5.2.2.1 秋水仙碱处理小青杨无菌苗叶片诱导同源多倍体
• 5.2.2.2 秋水仙碱处理后再生植株的倍性测定
• 5.2.2.3 再生植株的形态特征
• 5.3 讨论
• 6. 结论
• 参考文献
• 图版
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢