论文摘要
一、目的1.研究健康汉族人中ABCB1基因多态性与启动子区域甲基化程度的分布特征及两者间的相关性。2.研究健康汉族人ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化水平对P-糖蛋白功能的影响。3.比较选择不同剂量的探药对P-糖蛋白功能评价的影响。4.初步探讨人外周血ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化程度对抗癫痫药物稳态脑脊液浓度的影响。二、方法1.健康汉族志愿者ABCB1基因多态性分析方法的建立207名健康受试者参加了本试验。采集受试者外周静脉全血2mL,利用本试验室改良的少量血样DNA快速抽提法提取genomic DNA,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对位于ABCB1基因11、12、21和26号外显子区域的G1199A、C1236T、G2677T/A以及C3435T几个重要位点进行基因多态性分析,并通过DNA直接测序来确认基因分型结果。使用SHEsis软件包对所检测到的ABCB1基因各SNPs在中国汉族人群中的发生频率及相互之间的连锁不平衡关系进行分析,单倍体型的构建则利用PHASE 2.1.1来完成。2.健康汉族人ABCB1启动子区域甲基化检测用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfiterestriction analysis,COBRA）对前述207名健康汉族人进行ABCB1启动子区域甲基化分析。1-2μg DNA稀释至50μL,变性后经亚硫酸氢钠硫化处理,使DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶,经PCR扩增、限制性内切酶酶切后非变性聚丙烯酰胺凝胶分离,EB染色后再进行灰度扫描。3.ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化程度对P-糖蛋白功能的影响及不同剂量的探药对P-糖蛋白功能评价的影响以P-糖蛋白经典探药——地高辛为模型药物,研究ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化程度对P-糖蛋白功能的影响;并同时观察了不同剂量水平的地高辛对P-糖蛋白功能评价的影响。地高辛血浆药物浓度采用雅培微粒子酶免疫试剂盒（DigoxinⅡ—5B73）进行定量测定。本试剂盒的标准曲线范围为0.3～4.0 ng·mL-1,最低定量限为0.3ng·mL-1,对超过4.0 ng·mL-1的样本稀释后再进行测定。低、中、高三个浓度(0.9、1.9和3.2 ng·mL-1)的质控样本批间变异度分别为10.1%、6.8%和5.3%。地高辛Cmax、Tmax来自实测值,AUC0-4通过DAS软件包计算而得。4.ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化程度对苯妥英钠、苯巴比妥稳态脑脊液浓度的影响35名服用苯妥英钠和40名服用苯巴比妥的神经外科住院患者参与了本实验。在患者持续规律给药达到7～10天后,同时采集其下次给药前的血标本6mL和脑脊液标本2mL;其中2mL全血用于DNA抽提,另外4mL离心后保留血浆用于血中药物浓度测定。采用前述方法1和方法2对75名患者进行ABCB1基因分型和启动子区域甲基化分析,利用本实验室建立的HPLC—UV法进行苯妥英钠和苯巴比妥稳态血浆和脑脊液药物浓度测定。采用色谱条件为:UltimateTMColumn AQ-C18柱（250mm×4.6mm,5μm,USA）,柱温40℃,检测波长:220nm,流动相:乙腈:30mmol·L-1醋酸铵（含0.25%甲酸）（50∶50,v/v）,流速:1.0ml·min-1,进样量20μl,样品处理采用液-液萃取,内标为阿普唑仑。苯巴比妥、苯妥因钠和内标的保留时间分别为4.8、7.1和9.2min。苯巴比妥、苯妥英钠的检测范围分别为:1.0～62.5μg·mL-1和0.1～40.25μg·mL-1。分析ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化程度与患者稳态血浆、脑脊液药物浓度及脑脊液/血浆药物浓度比值间的相关性,考察ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化对苯妥英钠和苯巴比妥稳态脑脊液浓度的影响。5.统计方法所有统计均使用SPSS13.0软件进行数据的分析。Hardy-Weinberg检验采用卡方检验。不同基因型之间的药代动力学参数和启动子区域甲基化程度差异使用Kruskal-Wallis method和Mann-Whitney U检验,药代动力学参数与启动子区域甲基化程度的相关性分析使用Spearman法。P＜0.05被认为有统计学意义。三、结果1.ABCB1基因多态性在健康汉族人群中的分布尽管在白种人中的突变发生频率为6.5%～11%（最近,体外实验已经证实G1199A的突变可以改变蛋白转运活性）,但在207个健康汉族人中并没有发现G1199A的突变等位基因存在。本研究进一步证实了ABCB1的3个主要SNPs在中国人群中的基因频率和单倍体型频率。ABCB1 C1236T、G2677T/A和C3435T在健康汉族志愿者中的突变发生频率分别为66.6%、41.6%、16.3%和40.4%,这些等位基因的发生频率符合Hardy-Weinberg平衡。在健康汉族志愿者中,ABCB1的C3435T单核苷酸多态性的野生型纯合子CC的频率为35.1%,突变型纯合子TT的频率为15.9%,突变型杂合子CT的频率为49.0%;ABCB1的C1236T单核苷酸多态性的野生型纯合子CC的频率为14.4%,突变型纯合子TT的频率为47.6%,突变型杂合子CT的频率为38.0%;ABCB1的G2677T/A单核苷酸多态性的野生型纯合子GG的频率为16.3%,突变型纯合子中TT的频率为16.8%,TA的频率为10.6%,AA的频率为4.8%,突变型杂合子GT的频率为38.9%,GA的频率为12.5%。利用SHEsis和Phase 2.1.1软件对C1236T、G2677T/A和C3435T位点进行连锁不平衡分析和单倍体型构建发现:位于26号外显子的C3435T位点与12号外显子C1236T位点和21号外显子G2677T位点之间存在明显的连锁不平衡关系;在健康汉族人中以T-T-T、C-G-C、T-G-C和C-A-C这四个单倍体型为主,占到90%以上。2.健康汉族人ABCB1启动子区域甲基化程度在207个健康汉族人中,ABCB1启动子区域甲基化水平中位数为13.2%（3.2%～28.7%）,男女之间没有发现性别差异。此外,3435CC、3435CT和3435TT型个体间ABCB1启动子区域甲基化水平存在明显差异（P＜0.05）,3435CC型个体甲基化水平较低,3435TT个体最高;而G2677T/A野生型纯合子个体相对于突变型纯合子（TT、AA、TA）和杂合子（GT、GA）个体均表现出较低的甲基化水平（P＜0.05）,但在后两者之间没有明显差异。在不同的单倍体型个体中,TTT携带者显示出较非TTT携带者较高的甲基化程度（P＜0.01）,而TGC携带者显示出较非TGC携带者较低的甲基化程度（P＜0.05）。3.ABCB1基因多态性对不同剂量地高辛药动学的影响受试者在口服低（0.25 mg）、中（0.5 mg）、高（0.75 mg）三个剂量水平的探药后,其AUC0-4、Cmax和Tmax除与剂量水平相关外,在不同ABCB1 SNPs的个体中没有明显差异。然而,在将受试者按照所构建的ABCB1单倍体型分组后,在0.25mg剂量组内,TGC-CGC个体内地高辛AUC0-4、Cmax明显降低于TTT-TTT的个体（p＜0.05）。4.ABCB1启动子区域甲基化水平对不同剂量地高辛药动学的影响在对ABCB1启动子区域甲基化程度与不同剂量地高辛的AUC0-4、Cmax和Tmax进行相关性分析后,同样发现ABCB1启动子区域甲基化水平仅与0.25mg剂量组的AUC0-4和Cmax呈正相关（p＜0.05）,但没有发现ABCB1启动子区域甲基化水平与0.5mg和0.75mg剂量组AUC0-4和Cmax存在相关性。5.ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化水平对苯妥英钠稳态脑脊液浓度的影响在35名服用苯妥英钠的住院患者中发现:ABCB1启动子区域甲基化程度与患者苯妥英钠稳态脑脊液/血浆浓度比值存在负相关（r=-0.407,p=0.015）,但并没有发现ABCB1单核苷酸多态性或其单倍体型对苯妥英钠稳态脑脊液或血浆浓度及两者比值存在明显影响。6.ABCB1基因多态性和启动子区域甲基化水平对苯巴比妥稳态脑脊液浓度影响在40名使用苯巴比妥的住院患者中,没有发现ABCB1 SNPs、单倍体型或者其启动子区域甲基化水平对苯巴比妥的稳态脑脊液、血浆药物浓度及脑脊液/血浆药物浓度比值存在明显影响。四、结论本研究首次发现位于11号外显子的G1199A在中国健康志愿者中不存在突变,说明该位点的突变存在明显的地域或种族差异。实验所得中国汉族人ABCB1基因常见SNPs和主要单倍体型的发生频率与其他实验室在中国人群中的研究结果基本一致,各等位基因频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡,研究资料具有群体代表性。本研究首次对健康汉族志愿者ABCB1启动子区域甲基化水平进行了大样本检测,并发现ABCB1不同SNPs和单倍体型个体中启动子区域甲基化水平存在明显差异。这提示ABCB1基因多态性和表观遗传学差异间存在某种关联,为探索ABCB1同义突变导致P-糖蛋白表型差异的机制提供了新的思路。本研究观察了地高辛给药剂量的不同对P-糖蛋白功能评价的影响,并从基因多态性和表观遗传学差异两方面证实了低剂量地高辛能够更好的体现个体间P-糖蛋白功能的差异。这对以前研究所得的矛盾结果及以后的研究具有提示和借鉴意义。本研究初步探讨了ABCB1遗传多态性和表观遗传学差异对苯妥英钠、苯巴比妥稳态脑脊液浓度的影响,仅发现患者ABCB1启动子区域甲基化程度与苯妥英钠稳态脑脊液/血浆药物浓度比值存在负相关,并没有发现ABCB1的基因多态性和启动子区域甲基化水平对苯巴比妥稳态脑脊液浓度的影响。由于缺乏患者血脑屏障和脑组织局部P-糖蛋白表达和功能的直接依据,还不能就P-糖蛋白对此类药物的脑内浓度的影响做出明确结论。但通过本试验,也说明了在体研究人药物转运蛋白对中枢神经系统药物体内处置和反应差异的试验难度和复杂性。