天然丙烯基苯化合物微生物转化和代谢的研究

论文摘要

精油也称为芳香油，它是以香料植物的花、根、叶、茎等为原料，经蒸馏、萃取或压榨等工艺提取的具有香味的油性物质。有些精油的主要成分是具有丙烯基苯结构的化合物，这些物质通常作为化学法合成香料的起始原料。如果采用微生物或者酶法转化这类丙烯基苯结构化合物，就有可能得到高附加值的天然生物香料。丁香酚和异丁香酚是丁香叶油的主要成分，具有典型的丙烯基苯结构，是合成香兰素的初始物。因此本课题选择这两种化合物作为丙烯基苯化合物的模式物，筛选能转化此类物质的微生物，以获得有价值的芳香化合物；同时对影响转化的因素、相关代谢途径、代谢规律及产物分离纯化条件进行了探讨。本工作通过从果园土样中筛选耐受高浓度丁香酚和异丁香酚的微生物、检验菌株代谢底物能力，获得了一株能够在10gl-1异丁香酚浓度下生长的菌株HS8，确定其可以代谢异丁香酚并产生香兰素。菌株HS8为典型的杆状菌，无分枝，多呈二联体；革兰氏染色为阳性；有椭圆形芽孢，芽孢位于菌体的中部；菌株严格好氧；过氧化氢酶实验、明胶淀粉水解实验、硝酸盐还原实验、V-P实验和柠檬酸盐的利用实验均呈阳性反应；能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、D-木糖和L-阿拉伯糖产酸。HS8的16S rDNA序列（GenBank accession No．DQ309333）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的16S rDNA序列相似性超过99％。根据上述结果，HS8被鉴定为枯草芽孢杆菌，并命名为B．subtilis HS8。初步研究了B．subtilis HS8转化异丁香酚的基本特性。异丁香酚对细胞有毒性，B．subtilis HS8具有较强的耐受异丁香酚毒性的能力。在0.5％异丁香酚存在时，HS8繁殖能力能够达到正常条件下的85％。当异丁香酚浓度超过1.0％时，HS8生长受到明显抑制。在2％异丁香酚存在时，不能观察到菌体的生长，显微镜下观察到菌体发生自溶。HS8能够转化1gl-1异丁香酚生成0.21gl-1香兰素。由于B．subtilis HS8具有的耐受较高浓度异丁香酚、转化异丁香酚生成香兰素的特征，该菌株被选择作为本课题研究的主要菌株。以提高香兰素产量为目标，对HS8转化异丁香酚的条件进行了优化。培养基的碳氮源选择表明，葡萄糖和蔗糖是菌体生长的最佳碳源，豆饼粉不仅有利于

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摘要

ABSTRACT

第一章前言

1. 天然丙烯基苯化合物概况

1.1 天然丙烯基苯化合物的分布

1.2 精油单离产物中的丙烯基苯化合物

1.3 天然丙烯基苯化合物的用途

2. 丙烯基苯型精油单分的开发利用

2.1 丁香酚

2.2 异丁香酚

2.3 茴香脑

2.4 黄樟脑

3. 丙烯基苯型精油单分的微生物代谢

3.1 丁香酚的微生物代谢

3.2 异丁香酚的微生物代谢

3.3 异黄樟脑的微生物代谢

3.4 茴香脑的微生物代谢

4. 生物香兰素

4.1 可生物转化产香兰素的底物

4.2 生物香兰素生产工艺过程的研究

4.3 微生物转化产香兰素的代谢途径研究

5. 本课题的研究意义与思路

5.1 本课题的研究意义

5.2 本课题的研究思路

5.3 论文研究路线

第二章转化丁香酚或异丁香酚的微生物筛选及菌株鉴定

1. 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.2 菌株和培养基

1.3 检测方法

1.4 菌株鉴定

1.5 菌种保藏

1.6 菌株耐受异丁香酚能力的比较

2. 结果和讨论

2.1 样品检测方法的确定

2.2 菌株的筛选

2.3 菌株鉴定

2.4 菌株 HS8的转化特征

3. 小结

第三章菌株 HS8转化异丁香酚产香兰素的条件优化

1. 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

1.2 菌种及培养基

1.3 实验方法

2. 结果与讨论

2.1 碳源的选择

2.2 氮源的选择

2.3 添加异丁香酚的研究

2.4 高浓度菌体转化

2.5 溶氧和传质对转化的影响

2.6 影响转化的其他因素

2.7 钴60诱变和 NTG诱变育种筛选高产菌株

2.8 添加香兰酸反馈抑制香兰素氧化反应

3. 小结

第四章菌株 HS8代谢异丁香酚途径分析

1. 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.2 菌株与培养基

1.3 生物转化

1.4 代谢产物的萃取和浓缩

1.5 代谢产物的分析方法

1.6 香兰酸脱羧酶酶活力测定

2. 实验结果与讨论

2.1 转化酶基本性质的研究

2.2 菌株 HS8生长细胞体系转化异丁香酚

2.3 气相色谱检测代谢产物

2.4 GC/HRMS鉴定代谢物

2.5 菌株 HS8休止细胞代谢香兰素及其衍生物

2.6 HS8代谢异丁香酚途径

3. 小结

第五章三种微生物代谢丙烯基苯化合物规律的初步研究

1. 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.2 菌株与培养基

1.3 丙烯基苯化合物的代谢

1.4 检测方法

2. 结果与讨论

2.1 三株菌株对丁香酚的耐受和代谢

2.2 三株菌株对异丁香酚的耐受和代谢

2.3 三株菌株对香兰素和香兰酸的代谢

2.4 三株菌株对阿魏酸的代谢

2.5 菌株HS8对t-茴香脑及其异构体的代谢

3. 小结

第六章香兰素的提取工艺研究

1. 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.2 方法

2. 结果与讨论

2.1 发酵液的基本性质

2.2 发酵液的预处理

2.3 萃取剂的选择

2.4 萃取pH的选择

2.5 反应萃取分离香兰素和异丁香酚

2.6 萃取工艺流程的确定

3. 小结

第七章结论与展望

1. 结论

1.1 可降解异丁香酚微生物的筛选

1.2 异丁香酚转化条件优化

1.3 三种微生物代谢丙烯基苯化合物的研究

1.4 提取工艺的研究

2. 研究的创新点

3. 对于本工作的展望

附录

1. 气相色谱检测香兰素和异丁香酚标准曲线

2. 高效液相色谱检测香兰素和异丁香酚标准曲线

3. 菌体干重与OD值的标准曲线

4. 菌株测序结果

4.1 菌株 HS8 16S rDNA测序结果

4.2 菌株 NI3 16S rDNA测序结果

4.3 菌株 F13 16S rDNA测序结果

参考文献

致谢

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