产邻苯二酚菌株的筛选及相关基因的克隆

论文摘要

本工作从土壤中筛选到一株能利用苯甲酸钠产邻苯二酚的假单胞菌株B3-1。通过对菌株B3-1在不同底物浓度、温度和pH条件下产邻苯二酚条件的优化，邻苯二酚产量最高能达到1.57mg／mL，其最适生长条件为32℃、pH 6.0～7.0，产邻苯二酚的最佳底物浓度为3mg／mL。以假单胞菌B3-1为出发菌株，进行了固定化细胞生产邻苯二酚的初步研究。通过明胶、海藻酸钠和聚乙烯醇三种固定化材料的比较，最终确定了使用海藻酸钠作为固定化载体。通过正交实验，固定化的最佳条件为：菌体量0.3 g／mL；氯化钙浓度为4％；海藻酸钠浓度为3％；钙化时间为4小时。用柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建了Pseudomonas sp．B3-1含约20000个克隆的基因组文库，随机挑取其中的14个克隆提取质粒进行BamHI酶切分析，结果显示所有的质粒都含有插入片段，最大为52kb，最小为31kb，平均大小为41.5 kb，14个质粒的酶切带型都不相同，说明文库克隆的外源DNA片段随机性比较大。通过活性筛选得到含编码邻苯二酚合成基因的阳性克隆45个。从阳性克隆Ben19中得到苯甲酸双加氧酶基因benABCD，BlastX表明该序列与来自于Pseudomonas entomophila str．L48（GenBank索引号：CT573326）的苯甲酸双加氧酶ben基因簇有91％的同源性。benA具有一个1329bp的ORF，可编码含442个氨基酸的蛋白质，编码产物与来自假单胞菌的苯甲酸钠双加氧酶BenA（GenBank索引号AAX47023.1）具有96％一致性和99％相似性。benB具有一个486bp的ORF，编码含161个氨基酸的蛋白质，编码产物与来自Pseudomonas entomophila str．L48的苯甲酸钠双加氧酶BenB（GenBank索引号AAX47024.1）具有91％一致性和97％相似性。benC具有一个1011bp的ORF，编码含336个氨基酸的蛋白质，编码产物与来自假单胞菌的苯甲酸钠双加氧酶BenC（GenBank索引号AAX47025.1）具有93％一致性和98％相似性。benD具有一个762bp的ORF，编码含253个氨基酸的蛋白质，编码产物与来自假单胞菌的苯甲酸二醇脱氢酶BenD（GenBank索引号AAK52290.1）具有79％一致性和88％相似性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 邻苯二酚
• 1.1.1 邻苯二酚的应用及生产现状
• 1.1.2 化学法合成邻苯二酚
• 1.1.3 生物法合成邻苯二酚
• 1.2 苯甲酸钠
• 1.2.1 苯甲酸盐降解代谢途径
• 1.3 固定化细胞技术
• 1.3.1 固定化载体
• 1.3.1.1 有载体固定化细胞
• 1.3.1.2 无载体固定化细胞
• 1.3.2 固定化细胞的制备方法
• 1.3.2.1 吸附法
• 1.3.2.2 包埋法
• 1.3.2.3 共价结合法
• 1.3.2.4 变联法
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 土壤样品来源
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.1.3.1 培养基
• 2.1.3.2 培养条件
• 2.1.4 菌体保存
• 2.1.5 抗生素
• 2.1.6 溶液、缓冲液和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒DNA的提取
• 2.2.1.1 快速碱裂解法提取质粒
• 2.2.1.2 质粒DNA的大量提取
• 2.2.1.3 试剂盒大量提质粒
• 2.2.1.4 试剂盒快速提取质粒
• 2.2.2 细菌总DNA的蛋白酶/SDS提取法
• 2.2.3 DNA的酶切、电泳及DNA片段浓度测算
• 2.2.3.1 DNA酶切
• 2.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3.3 DNA片段浓度测算
• 2.2.4 DNA片段的回收
• 2.2.4.1 低熔点琼脂糖凝胶法
• 2.2.4.2 电透析法回收DNA片段
• 2.2.4.3 试剂盒法快速回收DNA片段
• 2.2.5 DNA的连接
• 2.2.5.1 载体质粒DNA的去磷酸化
• 2.2.5.2 DNA连接
• 2.2.6 质粒DNA以及DNA连接产物的转化
• 2法快速制备E.coli的感受态细胞'>2.2.6.1 CaCl₂法快速制备E.coli的感受态细胞
• 2.2.6.2 电脉冲转化
• 2.2.7 PCR扩增DNA片段
• 2.2.8 Cosmid文库的构建和筛选
• 2.2.8.1 文库的构建
• 2.2.8.2 文库的筛选
• 2.2.8.3 文库的保存
• 2.2.9 DNA-DNA杂交
• 2.2.9.1 Southern转移
• 2.2.9.2 探针标记一随机引物标记
• 2.2.9.3 Southern杂交
• 2.2.10 邻苯二酚的测定
• 第三章 产邻苯二酚菌株的筛选鉴定与特性研究
• 3.1 产邻苯二酚细菌的分离和筛选
• 3.1.1 产邻苯二酚菌株的筛选
• 3.1.2 复筛
• 3.2 菌株B3-1的抗生素抗性检测
• 3.3 菌株B3-1生长和产邻苯二酚的最佳条件
• 3.3.1 不同苯甲酸钠浓度的影响
• 3.3.2 最适生长温度及邻苯二酚的产量
• 3.4 菌种鉴定
• 3.4.1 菌落形态与生理生化特征
• 3.4.2 16SrDNA序列分析
• 3.4.3 PCR扩增
• 3.4.2.1 PCR产物的连接与转化
• 3.4.2.2 PCR扩增产物的测序
• 3.5 结果与讨论
• 第四章 固定化细胞生产邻苯二酚
• 4.1 固定化方法和材料的选择
• 4.2 固定化单因子条件优化
• 4.2.1 海藻酸钠浓度对邻苯二酚产量的影响
• 4.2.2 氯化钙浓度对邻苯二酚产量的影响
• 4.2.3 固定化时间对邻苯二酚产量的影响
• 4.2.4 包埋的菌体量对邻苯二酚产量的影响
• 4.3 正交实验
• 4.4 固定化细胞性能的改进与提高
• 4.5 结果与讨论
• 第五章 B3-1基因文库的构建与苯甲酸钠双加氧酶基因簇的克隆
• 5.1 基因文库的构建
• 5.1.1 假单胞菌B3-1总DNA的提取
• 5.1.2 B3-1基因文库的构建
• 5.2 苯甲酸钠双加氧酶基因簇的克隆
• 5.2.1 文库的筛选
• 5.2.2 苯甲酸钠双加氧酶基因簇的克隆
• 5.3 Southern杂交
• 5.4 序列拼接与分析
• 第六章 总结与讨论
• 6.1 本论文的工作总结
• 6.1.1 筛选到一株产邻苯二酚的菌株B3-1
• 6.1.2 建立并优化了Pseudomonas sp B3-1生产邻苯二酚的固定化反应体系
• 6.1.3 构建了Pseudomonas sp B3-1的基因组文库
• 6.1.4 克隆了苯甲酸双加氧酶基因簇的两个基因
• 6.2 本研究的后续工作
• 参考文献
• 致谢