根癌农杆菌C58六型分泌系统关键组分ClpV结构和功能的初步研究

论文摘要

细菌Ⅳ型分泌系统（Type VI Secretion System, T6SS）是近年发现的一种分布广泛且与细菌致病性密切相关的新型分泌系统。除了介导与宿主细胞的相互作用外,目前还发现Ⅳ型分泌系统还能介导细菌-细菌相互作用,并且细菌适应外界环境方面发挥着重要的作用。因此,深入研究T6SS分泌机制,不仅对于动植物病原细菌的治病机制研究和诊断方法的建立有重要的意义,同时由于T6SS所具有的独特的杀菌作用,在细菌耐药性已成为一个严峻现实的今天,对于发现新型抑菌策略,以及筛选新型抗菌药物均有潜在的巨大应用价值。因此,对于知之甚少的Ⅳ型分泌系统的研究已成为病原细菌领域一个新的研究热点。因此,我们对模式植物病原菌根癌农杆菌C58的Ⅳ型分泌系统进行了研究。通过生物信息学分析发现,ClpV型ATPase是不同细菌T6SS中均含有的关键保守组分,据推测可能为底物蛋白的分泌提供动力,但对其生化功能尚未进行深入鉴定。在本研究中,对ClpV型ATPase的结构和功能做了初步研究,其实验结果如下：1：检测ClpV型ATPase的ATPase活性并对其活性位点的分析：克隆根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens C58中的ClpV型ATPase基因alu4344并在大肠杆菌中表达,酶学检测证实了其ATPase活性,其最适pH为6.5,Vmax=42.8nmol min-1mg-1, Km=0.68mM,以及当Ac-离子浓度越高时,其活性越低。定点突变分析发现K232/608和E299/675均丧失ATPase活性,表明Walker A motif和Walker B motif与其活性密切相关。2:ClpV型ATPase蛋白结构的检测分析：利用非变性电泳分析发现ClpV型ATPase呈现一个多聚体状态,进一步用凝胶过滤和电镜分析发现Atu4344与T3SS中提供能量的InvC ATPase一样,呈现一个环状的六聚体结构。3：ClpV型ATPase聚合和解聚实验的检测分析：用pull-down方法进一步研究发现该ClpV型ATPase可与Atu4341和Atu4342形成的复合体相互作用,但与Atu4341或者Atu4342单独均不能相互作用,在ATP存在时Atu4344还可解聚Atu4341-Atu4342复合体。4:ClpV型ATPase功能的初步检测分析：研究发现,与野生型菌株相比,突变体(ClpV和点突变ClpV（K232/608）和ClpV（E299/675）菌株,其分泌蛋白Hcp分泌至胞外的蛋白量几乎为零,而在回复突变株中,Hcp蛋白的分泌得到一定程度的回复。5：通过酵母双杂交实验,检测农杆菌C58的T6SS中23个蛋白互作,勾画蛋白互作网络图。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1. 文献综述
• 1.1 细菌分泌系统（T1SS-T6SS）的简介
• 1.2 T6SS的功能简述
• 1.2.1 T6SS的致病作用
• 1.2.2 T6SS的抗致病作用
• 1.2.3 T6SS在细菌与细菌相互作用中的角色
• 1.3 T6SS基因表达的调控
• 1.3.1 T6SS基因表达受环境因素的调控
• 1.3.2 细菌体内调控T6SS表达的机制
• 1.4 T6SS目前研究的现状
• 1.5 ClpV型ATPase的介绍以及研究进展
• 1.6 模式生物简介
• 1.6.1 假结核耶尔森氏菌简介
• 1.6.2 根癌农杆菌C58的简介
• 1.7 本研究的目的和主要创新点
• 1.8 本论文研究路线
• 2. 材料与方法
• 2.1. 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 分子生物学试剂
• 2.1.3 引物序列
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 克隆构建
• 2.2.1.1 目的基因与载体的制备
• 2.2.1.2 感受态的制备及转化
• 2.2.1.3 重组子鉴定
• 2.2.2 定点突变
• 2.2.3 重组蛋白原核表达纯化及标签的切除
• 2.2.4 GST pull-down
• 2.2.5 Western blot
• 2.2.6 β-gal酶活测定
• 2.2.7 单交换菌株及缺失突变体的构建
• 2.2.8 酶活测定
• 2.2.9 蛋白多聚体检测法
• 2.2.10 蛋白多聚体检测法
• 2.2.11 电镜检测
• 2.2.12 酵母双杂交法
• 3 结果与分析
• 3.1 T6SS蛋白互作网络的构建
• 3.1.1 猎物克隆与饵克隆的构建
• 3.1.2 T6SS蛋白互作网络图的绘制
• 3.1.2.1 蛋白互作检测
• 3.1.2.2 蛋白互作网络
• 3.2 ClpV型ATPase的酶活检测
• 3.2.1 ClpV的结构分析
• 3.2.2 ClpV型ATPase及其定点突变克隆的构建和蛋白表达
• 3.2.2.1 clpV基因表达载体的构建
• 3.2.2.2 clpV基因在大肠杆菌中的表达
• 3.2.2.3 蛋白标签GST的切除
• 3.2.3 ClpV的酶学性质研究
• 3.2.3.1 ClpV的酶学活性的检测
• 3.2.3.2 盐离子浓度和pH对ClpV的酶学活性的影响
• 3.2.3.3 ClpV型ATPase的动力学分析
• 3.2.4 ClpV突变体的酶学分析
• 3.3 ClpV型ATPase的结构分析
• 3.3.1 ClpV型ATPase呈现一个多聚体
• 3.3.2 ClpV型ATPase呈现一个环状的六聚体状态
• 3.3.3 ClpV蛋白自身互作位点的分析
• 3.4 ClpV蛋白与Atu4341/Atu4342复合体之间的关系的研究
• 3.4.1 Atu4342介导ClpV蛋白与Atu4341/Atu4342复合体相互作用
• 3.4.2 ClpV蛋白依赖ATP重塑ClpV/Atu4341/Atu4342复合体
• 3.5 ClpV型ATPase的功能的研究
• 3.5.1 突变体及回复菌株的的构建
• 3.5.2 ClpV型ATPase的功能分析
• 4. 分析与讨论
• 4.1 T6SS相关蛋白的互作网络分析
• 4.2 T6SS关键组分ClpV型ATPase的酶活检测及影响因素
• 4.3 ClpV型ATPase呈现六聚体状态及自身互作位点的分析
• 4.4 ClpV型ATPase与Atu4341和Atu4342复合体之间的关系
• 4.5 ClpV型ATPase对Hcp分泌的影响
• 4.6 展望
• 5. 结论
• 参考文献
• 附录1 缩略语表
• 附录2 主要仪器设备
• 附录3 培养基及溶液配制
• 致谢