H5N1流感病毒样颗粒疫苗的研究

论文摘要

1997年出现人感染H5N1高致病性禽流感的首例病例[1],随后新病例不断增加,人们非常担心禽流感疫情很可能会导致新的一次人流感大流行。疫苗和药物在流感爆发的不同波段发挥作用,对防控流感有很好的效果。流感疫苗接种后7‐10天就开始产生相对应疫苗的保护性抗体,接种后抗体持续时间可以达到一年左右,因此接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方法[2]。现在,大量的疫苗是根据流行株在鸡胚中培养制备。然而,多年的实践表明,这种生产方式很难做到流感疫苗充足和及时供应。更重要的是,鸡胚培养技术不能应对大流感危机。因为H5N1禽流感病毒株常常致鸡胚死亡[3],必须花费数个月的时间获得能在鸡胚中繁殖与新毒株匹配的毒株。另外,由于高致病性禽流感的致病性,传统的禽流感疫苗生产工艺必须有生物安全三级设备的保障。因此,建立新的流感疫苗的技术方案是应对大流行的首要对策。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）是由多个结构蛋白组成,能模拟天然病毒粒子的组成、构造,然而不含有病毒基因组物质。与单个蛋白或多肽相比,VLPs呈现出与天然病毒粒子更相似的抗原决定簇,因此,作为免疫原能引起显著提高抗体应答和免疫系统反应。依赖表面大量重复性的抗原,VLPs在缺少佐剂的情况下,能通过与B细胞表面受体交联诱导强烈的B细胞反应[4、5]。昆虫-杆状病毒表达系统是一种能在昆虫细胞中表达重组蛋白的有效工具,与其他系统相比存在很多的优越性。基因表达在真核环境中进行,有利于蛋白的折叠和表达后修饰加工及装配;可以获得很高的蛋白表达量,并且操作安全;还可以通过共感染细胞同时表达两个或多个蛋白;使得这个系统尤其适合多亚基蛋白的表达,如制备VLPs[6]。流感病毒的HA蛋白具有很强的抗原表位,可刺激机体产生保护性免疫应答;NA特异性抗体可抵抗病毒的感染、减少病毒复制、阻断病毒传播;M1蛋白是一种多功能因子;流感病毒的HA、NA、M1三个蛋白即可自我包装成病毒样颗粒。M2蛋白对流感病毒样颗粒的包装具有促进作用,而且目前普遍接受M2作为广谱流感疫苗的抗原。本研究选择共表达A/goose/Jilin/hb/2003（H5N1）病毒的HA、NA蛋白和A/PR/8/34（H1N1）流感病毒的M1和M2蛋白,包装流感病毒样颗粒,制备rH5N1流感疫苗。首先,我们构建了含有切割位点多个氨基酸缺失突变的HA基因,并将其克隆到载体pFastBac Dual[7]的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nuclearpolyhedrosis virus,AcMNPV ）多角体蛋白启动子（Polyhedrin promoter, PpH）下游的NotI和HindⅢ位点之间,NA蛋白克隆到AcMNPV的P10蛋白启动子（P10 promoter,Pp10）下游的XhoI和SphI位点之间,命名为pFastDual-ΔHA-NA。同样的,M2基因克隆到pFastBac Dual的AcMNPV的PpH和下游的NotI和HindⅢ位点之间,并将M1基因克隆到Pp10下游的XhoI和SphI位点之间,即pFastDual-M1-M2。重组杆粒通过转化转移载体（pFastBac Dual-ΔHA-NA、pFastBac Dual-M1-M2）到大肠杆菌E. coli DH10Bac感受态细胞,通过特殊位点同源重组产生。这种菌株中包含预装的AcMNPV基因组和能编码Tn7转座酶的辅助质粒[8]。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定等方法筛选出含有重组杆粒的菌株,对最终筛选的阳性菌落提取重组杆状病毒DNA,得到了杆粒rBacmid-ΔHA-NA、rBacmid -M1-M2。将重组杆粒分别转染sf9细胞,5天后收获细胞培养上清,即获得重组杆状病毒（the recombinant baculoviruses rBVs）,通过空斑试验测定收获的重组杆状病毒的滴度,按病毒感染复数（MOI）值为0.1,富集高滴度的第二代（P2）病毒;继续按MOI值为0.1,扩大细胞数量和体积,富集第三代病毒（P3）,经富集后第三代病毒滴度达到1.0×108pfu/ml。用富集的重组杆状病毒rBV-ΔHA-NA-P3和rBV-M1-M2-P3分别感染HighFive昆虫细胞,通过Western-Blot分别检测到HA、NA、M1、M2四种蛋白,证明四种蛋白可以在该系统中表达。用两种重组杆状病毒共同感染无血清悬浮培养的HighFive昆虫细胞,感染复数均为5,制备VLPs。感染3天后收获感染上清,经浓缩后进行超速离心100,000×g,4h;离心沉淀重新悬浮后进行cellufine sulfate柱层析纯化。透射电镜观察到制备的VLPs形态与流感病毒一致,直径约80nm的球形,表面具有流感病毒的典型特征—穗花样结构;Western-Blot结果显示病毒样颗粒中包括HA、NA、M1、M2四种蛋白组分;血凝试验表明病毒样颗粒具有凝集鸡红细胞的活性,血凝效价约为128HAU/μg。最后,使用10μg的VLPs及佐剂采用腿部肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,初免后21天同样剂量加强免疫。免疫后所有的小鼠均表现健康,没有不良反应。初次免疫和加强免疫之前（0,21天）及每周采集血清,分别以293细胞制备的H5N1HA蛋白和鸡胚制备的H5N1病毒作为抗原,间接酶联免疫法检测血清HA特异性抗体和病毒特异性抗体,初免后VLPs诱导小鼠产生低的或检测不到的抗体,加强免疫后1周特异性抗体效价持续升高,至加强免疫后4周HA特异性抗体效价达1:40,000,病毒特异性抗体达到1:200,000,血凝抑制滴度达到1:1600,空斑减少试验检测到中和抗体效价达到1:160,说明病毒样颗粒具有较好的免疫原性。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统共表达A/goose/Jilin/hb/2003（H5N1）病毒的HA、NA蛋白和A/PR/8/34（H1N1）流感病毒的M1和M2蛋白,包装的流感病毒样颗粒能诱导小鼠产生中和H5N1流感病毒的抗体,四种蛋白组成的流感病毒样颗粒有作为疫苗的潜能。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• abstract
• 前言
• 第一章 利用昆虫细胞表达流感病毒结构蛋白HA、NA、M1 和M2
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 小结
• 第二章 制备rH5N1 流感病毒样颗粒
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 小结
• 第三章 流感病毒样颗粒的免疫原性
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 论著
• 个人简历
• 致谢