论文摘要
研究背景：药物研发对医疗进步有十分重要的作用。在过去的几十年,针对心血管,肿瘤,消化系统,疼痛等疾病的新药研发,为疾病治疗提供了更多选择,提高了人群健康水平,生活质量及平均寿命。药物研发是一个昂贵而且耗时的过程,尽管科技进步及投入增加,但是仍然有90%的新药不能成功进入临床。近十年以来,成功上市的新药呈逐年下降趋势,1996年有53种新药通过FDA认证,但是到2010年仅有15种。导致新药研发失败的原因有很多,其中一个主要原因是后期出现的各种药物毒性反应和药效作用不显著；药物研发过程会对候选药物的药代动力学,药效学,以及毒理学特征进行确认,但传统研发体系缺乏在早期能够准确高效分析药物代谢作用、毒性反应的技术工具。很大一部分药物进入体内后的代谢过程主要经由肝细胞完成。肝细胞含有各种参与体内外物质生物转化的酶类。细胞色素P450酶（Cytochrome P450 enzymes, CYPs, P450s）是一类含血色素巯基结构的单加氧酶蛋白超家族,是完成相关底物的去毒/生物活化作用的重要药物代谢酶。其中,CYP3A亚家族在肝脏含有P450s中含量最高,约占30%,是主要的临床药物代谢酶类。目前发现CYP3As包括有,CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7及CYP3A43等。CYP3A4在肝细胞中含量最高达40%,其他组织如小肠,肾脏,肺脏,脑组织等也有CYP3A4的低水平表达。有趣的是,关于脑组织中的表达,Ghosh C et al近期研究发现CYP3A4不仅参与了药物代谢,还有保护神经元细胞的作用。CYP3A4参与了50%的临床用药的代谢过程,药物代谢谱非常广泛,包括激素,免疫抑制剂,钙离子通道阻滞剂,咖啡因及抗生素等。其中硝苯地平,咪达唑仑及睾酮是CYP3A4的特异性底物,常被用于CYP3A4活性水平检测。有些药物,如曲格列酮,胺碘酮等,经CYP3A4代谢后能产生肝毒性,从而影响了其在临床的应用。一些环境致癌物质（如黄曲霉素B1）也是CYP3A4代谢依赖性的肝细胞毒性作用。另外,CYP3A4与药物相互作用也是密切相关的,大量临床用药已被证明可以诱导或抑制CYP3A4的活性,使与这些药物合用的其他药物的血浆浓度减低或升高,导致合用药物的疗效减弱,或升高甚至产生毒性作用。如特非那定,米贝地尔,阿司咪唑及西伐他丁,由于严重的药物相互作用已经退出了市场。鉴于CYP3A4在药物代谢过程中的重要作用,药物研发过程需要一个能够再现体内CYP3A4代谢作用的体外模型,用来集中评价CYP3A4对备选药物代谢作用和水平,以及备选药物对CYP3A4活性作用的影响。以肝脏药物代谢功能为主要对象,现今用于药物开发体外模型有,以亚细胞结构微粒体为作用单位的体外代谢模型,以细胞为作用单位的代谢模型（简称,细胞模型）,以及组织器官代谢模型。亚细胞结构模型中,人肝细胞微粒体是现今最常用的体外模型,因为其来源广,价格低廉且使用简单；Supersomes是基因工程昆虫细胞产生的微粒体,含有较高活性的CYP3A4;其他体外模型还有含有微粒体成分的人肝细胞s9成分等。这些体外模型不能真实反映体内CYP3A4对药物的代谢情况,也不能用于大致预测体内药物代谢水平的定量性分析,因此应用范围有限。组织和器官代谢模型是利用组织块或完整器官进行体外药物代谢测试的模型。这些模型虽然在最大程度上保证了代谢主体的完整性,这无疑有利于最大程度地再现体内代谢过程,但其来源罕有并且组织活性维持困难、成本高,所以大多难以常规开展。细胞是机体内最小的完整功能执行者；细胞模型,较单纯的生化模型、细胞器模型,具有更能体现机体生理活动的结构基础和功能能力；较组织器官代谢模型,在技术应用上具有更大的可行性。以细胞为基本功能单位成分的分析模型（Cell-based assay, CBA）的是现代药物研发技术中受到推崇而日益增多使用的模型工具。因此,寻找一个高表达CYP3A4的细胞模型,对药物开发就显得十分重要。研究目的：本实验以C3A细胞为研究对象,通过转染编码嵌合体PXR质粒,提高CYP3A4表达水平,并初步探讨其可能的作用机制,增强其在药物研发的应用潜质。实验方法：1.根据GenBank数据库收录的PXR及野生型P53-FD的基因序列,设计特异引物,采用PCR方法从正常人原代肝细胞来源的cDNA克隆PXR及野生型P53-FD基因序列；2.根据GenBank数据库收录的CYP3A4的基因序列,设计特异引物,采用PCR方法从正常人原代肝细胞来源的cDNA克隆CYP3A4 -362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列；3.通过限制性内切酶位点,将PXR及野生型P53-FD基因定向克隆到真核表达载体PCI-neo中,采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体PCI-PXR-P53；4.通过限制性内切酶位点,将PXR及野生型P53-FD基因定向克隆到真核表达载体PCI-neo中,采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体PCI-P53-PXR;5.通过限制性内切酶位点,将CYP3A4 -362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列定向克隆到真核表达载体PGL3-basic中,采用酶切、测序等方法筛选和鉴定重组真核表达载体CYP3A4-XREM.luc;6.将已经构建好的载体PCI-hPXR-P53用Nhe Ⅰ/BamH Ⅰ酶切下来,和pcDNA3.1（+）的Nhe Ⅰ/BamH Ⅰ酶切产物连接,得到一个中间载体pcDNA3.1-hPXR。在中间载体上获得EcoR I酶切位点。将pcDNA3.1-hPXR的Nhe I/EcoR I酶切产物和PCI-neo的Nhe I/EcoR I酶切产物连接,采用酶切鉴定亚克隆载体PCI-PXR。7.将目的质粒（PCI-PXR-P53、PCI-P53-PXR、PCI-PXR及PCI-neo）:报告基因质粒（CYP3A4-XREM.luc）:内参质粒（TK）分别按一定比例瞬时转染293T细胞。转染后24小时,利福平组加入利福平溶液,对照组加入DMSO,药物刺激48小时后,进行双荧光素酶检测。8.将目的质粒（PCI-PXR-P53或PCI-P53-PXR）:报告基因质粒（CYP3A4-XREM.luc）：内参质粒（TK）分别按一定比例瞬时转染C3A细胞。转染后24小时,利福平组加入利福平溶液,对照组加入DMSO,药物刺激48小时后,进行双荧光素酶检测。9.在24孔板中,按1×105个/ml的密度接种C3A细胞,每孔lml,37℃,5% CO2培养箱中静置培养,然后分别转染PCI-PXR-P53、PCI-P53-PXR、 PCI-PXR、PCI-neo。转染后24小时,利福平组加入利福平溶液,对照组加入DMSO。物刺激48小时后,收集细胞进行荧光定量PCR检测。实验结果：1.用特异性引物从正常人原代肝细胞cDNA中克隆到野生型P53-FD及PXR基因序列；2.通过限制性核酸内切酶,将野生型P53-FD及PXR基因定向克隆到真核表达载体PCI-neo中,筛选得到有P53-FD及PXR基因插入的真核表达载体PCI-PXR-P53及PCI-P53-PXR;3.用特异性引物从正常人原代肝细胞cDNA中克隆到CYP3A4 -362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列；4.通过限制性核酸内切酶,将CYP3A4 -362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列定向克隆到真核表达载体PGL3-basic中,筛选得到有CYP3A4-362至+53部分和-7838至-7208之间的调控序列基因序列插入的真核表达载体CYP3A4-XREM.luc;5.将已经构建好的载体PCI-hPXR-P53用Nhe Ⅰ/BamH Ⅰ酶切下来,和pcDNA3.1（+）的Nhe Ⅰ/BamH Ⅰ酶切产物连接,得到一个中间载体pcDNA3.1-hPXR。在中间载体上获得EcoR Ⅰ酶切位点。将pcDNA3.1-hPXR的Nhe Ⅰ/EcoR ⅠI酶切产物和PCI-neo的Nhe ⅠI/EcoR ⅠI酶切产物连接,通过酶切鉴定,得到亚克隆载体PCI-PXR;6.通过双荧光检测293T细胞中质粒PCI-PXR-P53、PCI-P53-PXR、PCI-PXR及PCI-neo对报告基因质粒的作用。Rif（+）组平均标准化的luciferase活性分别为4644±9.5,2899±385,320±23,2544±25,差异具有统计学意义（P<0.05）；Rif（-）组平均标准化的荧光素酶活性分别为344±11,2560±247,263±22,229±23,差异具有统计学意义（P<0.05）。7.通过双荧光检测C3A细胞中质粒PCI-PXR-P53、PCI-P53-PXR、PCI-PXR及PCI-neo对报告基因质粒的作用。Rif（+）组平均标准化的荧光素酶活性分别为6633±443,20046±2806,1539±137,626±94,差异具有统计学意义（P<0.05）；Rif（-）组平均标准化的荧光素酶活性分别为4098±920,16391±2412,435±168,732±93,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.在C3A细胞瞬时转染质粒PCI-PXR-P53、PCI-P53-PXR、 PCI-PXR及PCI-neo通过荧光定量PCR检测CYP3A4mRNA变化。Rif（+）组CYP3A4 mRNA2-△△ct值分别为9.52±2.61,6.01±0.27,3.82±0.15,1.57±0.11,差异具有统计学意义（P<0.05）; Rif（-）组CYP3A4mRNA2-△△ct值分别为8.07±0.11,6.36±0.94,2.37±0.22,1.02±0.02,差异具有统计学意义（P<0.05）；实验结论：成功构建了PCI-PXR-P53、PCI-P53-PXR、PCI-PXR及CYP3A4-XREM.luc 4个真核表达载体,进行了双荧光检测发现嵌合PXR （PCI-PXR-P53及PCI-P53-PXR）对CYP3A4启动子的激活作用比PCI-PXR更高,并通过荧光定量PCR进一步证实了嵌合PXR对CYP3A4激活转录作用更强。