柴胡皂苷a对PTZ激活大鼠海马星形胶质细胞TNF-α释放及其受体表达的影响

论文摘要

一、目的与意义癫痫是一种常见的神经系统反复发作性疾病,以脑部神经元异常放电而导致的短暂大脑功能失调为特征。由于癫痫患者常伴个人、家庭和社会等方面的问题,如何有效地控制癫痫发作,一直是癫痫治疗学上的难题。目前化学药物仍然是控制癫痫发作最常用、最重要的手段,但常用一线抗癫痫药（AEDs）只能对70%左右的痫性发作有控制作用,并不能防止癫痫灶的形成,更不能影响癲痫的自然进程。同时伴有各种不良反应,长期应用安全性较差,使多数患者依从性下降,因此迫切需要研究使用新型抗癫痫药。癫痫的发病机制仍未明确,但神经元兴奋性增高和高度同步化电发放被公认为癫痫发病的两个重要特征。近年来对星形胶质细胞与神经突触信号传递的认识逐渐深入。星形胶质细胞主要存在于中枢神经系统内,起支持、分隔神经元及绝缘的作用,可以调节细胞内外离子浓度、pH值等,对维持内环境稳定起重要作用,通过受体（包括胞膜和胞浆受体）、神经活性氨基酸亲和载体、酶类参与神经递质摄取、灭活和供给。癫痫的发病机制中,除了神经元病理及功能方面的明显改变外,星形胶质细胞存在着不可忽视的功能和形态方面的异常,即星形胶质细胞的活化,又称反应性胶质增生,表现为胞体肥大、突起增多延长、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增强。激活的星形胶质细胞对神经突触传递施加影响,增加神经元兴奋性,进而引起癫痫的发作,故认为星形胶质细胞可能是治疗癫痫的目标靶细胞。星形胶质细胞本身可分泌多种细胞因子参与癫痫疾病的发生、发展及转归。细胞因子是人体多种细胞内产生的一类多肽类物质,具有调节人体器官、组织发育和细胞生长等广泛的生物学效能。其作为神经-免疫-内分泌网络的重要因素在免疫应答和炎性反应中起介导和调节作用。有研究发现癫痫患者和癫痫大鼠模型存在细胞因子水平的升高,并参与激活星形胶质细胞,激活细胞信号传导通路。如激活的星形胶质细胞通过分泌包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在内的细胞因子参与免疫应答,而过度表达的TNF-α作用于星形胶质细胞上的受体又可以激活星形胶质细胞引起反应性胶质增生,使GFAP表达增加,与癫痫的反复发作有关。TNF-α在中枢神经系统由星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元产生,通过脑内广泛存在的TNF-α受体参与神经-免疫-内分泌网络的调控。研究发现癫痫患者及癫痫模型的动物脑组织和脑脊液TNF-α及其mRNA的水平均明显升高,在应用mTNF-α抗体处理后可以降低小鼠惊厥发作的敏感性,可见TNF-α参与了癲痫发生机制。柴胡为临床常用中药之一,柴胡皂苷a（SSa）为柴胡中主要药理成分柴胡皂苷的一种单体成分,本课题组在前期研究中发现柴胡总皂苷具有抗癫痫的作用,能够抑制癫痫大鼠星形胶质细胞数量的增加及GFAP的异常高表达,进一步研究提示SSa可能为其抗癫痫作用的主要有效成分。SSa可延长戊四氮（PTZ）诱发的大鼠痫性发作的潜伏期,降低大鼠强直性惊厥发生率,能有效地抑制PTZ致痫大鼠痫性发作。为进一步探索SSa是否可以通过细胞因子途径发挥抗癫痫作用,本研究观察了PTZ诱导体外培养的大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达、TNF-α释放、肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）的表达水平,并结合体内动物实验观察了PTZ急性致痫大鼠海马TNFR1的动态表达变化及SSa的干预作用。二、方法与内容1.SSa对PTZ激活大鼠海马星形胶质细胞TNF-α释放及受体表达的影响1.1大鼠海马星形胶质细胞的原代培养与鉴定大鼠海马星形胶质细胞的体外原代培养参考McCarthy法并加以改进。取1-3d新生Sprague-Dawley（SD）大鼠,消毒、开颅、剔除血管及脑膜分离出海马,分别经剪碎、消化、离心后,差速贴壁40 min,按106个/ml密度以含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基接种。37.0℃,5%CO2孵箱中培养7-9d,待培养的细胞70%-80%融合时,将培养瓶置于恒温旋转摇床（37.0℃,240 r/min）上摇18 h后,进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞。纯化的星形胶质细胞进一步运用免疫细胞化学SABC法进行鉴定。1.2噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性将培养传代的细胞以7×104个/ml的密度,用15%完全培养基接种于96孔培养板中,每孔种植200μl。继续培养48 h后,用于实验。①SSa不同浓度单用对正常细胞的活性影响分为3组:对照组（A组）,SSa不同剂量单用组（B组、C组,分别为1.25 mg/L、0.625 mg/L）,SSa处理6 h后用MTT法测OD值。②SSa对PTZ激活的星形胶质细胞活性的影响分为4组:对照组（A组）,PTZ 10 mmol/L激活组（B组）,PTZ 10 mmol/L+SSa不同剂量干预组（C组、D组,SSa剂量分别为1.25 mg/L、0.625 mg/L）。用药组经SSa预处理6 h后,给予PTZ 10 mmol/L刺激2 h,后用MTT法测OD值。每组设6孔,用含5%胎牛血清的培养基配制不同药物,每孔加入200 ul。1.3 SSa对PTZ激活的大鼠海马星形胶质细胞培养上清液TNF-α、细胞GFAP、TNFR1表达的影响将培养传代的细胞以5×105个/ml的密度种植于直径10mm的培养皿中,培养48 h后,DMEM/F12无血清培养基血清剥夺24 h,将细胞随机分为4组:对照组（A组）,PTZ 10 mmol/L激活组（B组）,PTZ 10 mmol/L+SSa不同剂量干预组（C组、D组,SSa分别为1.25 mg/L、0.625 mg/L）。用DMEM/F12无血清培养基配制不同药物,用药组经SSa预处理6 h后,给予PTZ 10 mmol/L刺激2h,后收集细胞上清液,用ELISA法检测TNF-α的含量;同时用全蛋白提取试剂盒提取蛋白,考马斯亮蓝法蛋白定量以确定上样量,运用Western-blot技术检测星形胶质细胞GFAP和TNFR1表达的变化。对结果进行光密度分析,计算不同蛋白与β-actin的比值,每组蛋白检测6次。2.SSa对PTZ急性致痫大鼠海马TNFR1表达动态变化的影响采用经典的PTZ致痫法建立大鼠急性癫痫模型。将96只健康SD大鼠随机分为4组,即对照组（A组,6只）、模型组（B组,30只）、SSa组（C组,30只）和VPA组（D组,30只）,各组给予以上不同处理因素预处理30 min后,除对照组给予腹腔注射生理盐水外,其余各组均给予腹腔注射60 mg/kg PTZ制作大鼠急性痫性发作模型。其中B组、C组和D组各随机分为5个小组,分别于观察大鼠痫性发作后1/2 h、2 h、4 h、8 h和12 h获取脑组织标本,运用免疫组织化学法检测海马区TNFR1蛋白表达的变化。3.统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件。计量资料均用均数士标准差（（?）±S）描述,MTT比色法结果、ELISA结果和Western-blot检测结果比较运用单因素方差分析（One-way ANOVA）;免疫组织化学结果运用析因分析,LSD法多重比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。三、结果1.SSa对PTZ激活大鼠海马星形胶质细胞TNF-α释放及受体表达的影响1.1大鼠海马星形胶质细胞的原代培养与鉴定原代培养的大鼠海马星形胶质细胞,镜下观察可见星形胶质细胞生长较好,所有细胞均贴壁,可见光晕,胞突明显,细胞向外伸出长短不一的突起,胞质丰富,胞质中卵圆形的细胞核清晰可见。该星形胶质细胞运用免疫细胞化学染色法鉴定,细胞GFAP免疫反应阳性率为95%以上。1.2噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性SSa不同浓度单用对正常细胞的活性影响,结果显示:SSa1.25 mg/L、0.625mg/L不同剂量组与对照组OD值分析比较差异无统计学意义（P>0.05）,提示SSa本身对细胞活性无明显影响。在此基础上进一步研究SSa对PTZ激活的星形胶质细胞活性的影响,结果显示:含PTZ 10 mmol/L的激活组OD值高于对照组和SSa不同剂量组且差异有显著性意义（P<0.05）,说明PTZ对正常星形胶质细胞有激活作用,SSa可抑制PTZ对星形胶质细胞的异常激活,且SSa 1.25 mg/L、SSa 0.625 mg/L不同剂量组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.3 SSa对PTZ激活的大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响Western blot条带光密度分析显示:含PTZ 10 mmol/L的激活组GFAP光密度值较对照组和SSa不同剂量组显著增加（P<0.01）,说明PTZ激活的星形胶质细胞特异性蛋白GFAP表达量显著增加,SSa 1.25 mg/L、SSa 0.625 mg/L不同剂量可使激活的星形胶质细胞GFAP表达量下降。其中SSa 1.25 mg/L给药组光密度值与对照组比较,差异无统计学意义（P=0.120）1.4 SSa对PTZ激活的大鼠海马星形胶质细胞培养上清液TNF-α表达的影响ELISA结果显示:含PTZ 10 mmol/L的激活组TNF-α表达水平较对照组和SSa不同剂量组显著增加（P<0.01）,说明PTZ刺激后星形胶质细胞培养上清液中TNF-α表达水平迅速升高,SSa1.25 mg/L、SSa 0.625 mg/L不同剂量可使激活的星形胶质细胞上清液中TNF-α表达水平降低。其中SSa 1.25 mg/L给药组与对照组比较,差异无统计学意义（P=0.744）。1.5 SSa对PTZ激活的大鼠海马星形胶质细胞TNFR1表达的影响Western blot条带光密度分析显示:含PTZ 10 mmol/L的激活组TNFR1光密度值较对照组和SSa不同剂量组显著增加（P<0.01）,说明PTZ激活的星形胶质细胞TNFR1表达量显著增加,SSa 1.25 mg/L、SSa 0.625 mg/L不同剂量可使激活的星形胶质细胞TNFR1表达量下降。其中SSa 1.25 mg/L给药组光密度值与对照组比较,差异无统计学意义（P=0.386）。2.SSa对PTZ急性致痫大鼠海马TNFR1表达动态变化的影响模型组大鼠腹腔注射PTZ后,均在1-2 min内出现痫性发作。TNFR1的免疫反应阳性产物为胞膜胞核均有表达。模型组大鼠免疫反应阳性细胞较对照组着色增强,SSa组与VPA组免疫反应阳性细胞较模型组着色减弱。免疫反应阳性产物光密度分析显示:在PTZ急性致痫后大鼠海马TNFR1表达存在动态变化,先迅速升高（P<0.05）,后逐步下降,12 h内又缓慢接近正常水平,而SSa和VPA对其在PTZ急性致痫后含量的迅速升高有一定的抑制作用。四、结论1.SSa可抑制PTZ激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞引起的反应性胶质增生,抑制GFAP的过度表达。2.SSa可抑制PTZ激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞的培养液中TNF-α含量的迅速升高。3.SSa可抑制PTZ激活体外培养大鼠海马星形胶质细胞TNFR1表达的迅速升高。4.动物实验中,PTZ急性致痫后大鼠海马TNFR1的表达存在显著的动态变化,在致痫后迅速升高随之下降,而后又缓慢接近正常水平,SSa和VPA对于PTZ急性致痫后TNFR1的迅速升高存在一定的抑制作用。SSa抗癫痫机制可能通过作用于PTZ激活星形胶质细胞TNF-α释放的信号转导通路从而影响兴奋性神经递质,及活性物质的转录、释放。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 统计方法
• 结果
• 1.SSa对PTZ激活培养的大鼠海马星形胶质细胞TNF-α释放及其受体表达的影响
• 1.1 大鼠海马星形胶质细胞的原代培养和鉴定
• 1.2 MTT法检测SSa对大鼠海马星形胶质细胞活性的影响
• 1.3 SSa对PTZ激活大鼠海马星形胶质细胞GFAP表达的影响
• 1.4 SSa对PTZ激活大鼠海马星形胶质细胞培养液TNF-α表达的影响
• 1.5 SSa对PTZ激活的大鼠海马星形胶质细胞TNFR1表达的影响
• 2.SSa对PTZ急性致痫大鼠海马TNFR1表达动态变化的影响
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略语表
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢
• 统计学审稿证明