论文题目: 海洋放线菌抗MRSA菌株的筛选及菌株AM105活性物质的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 黄惠琴
导师: 鲍时翔
关键词: 放线菌,小单孢菌抑菌活性物质,菌种鉴定,发酵,分离纯化,结构鉴定
文献来源: 华南热带农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分离率不断升高,临床上可供选择的药物极少,MRSA已成为难以治疗的“超级细菌”,极大地危害着人类健康,人们必须不断寻找新的药源。新药的开发已突破陆生资源的束缚,拓展到生态和物种远比陆地生境复杂多样的海洋,独特的海洋环境使海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上呈现较高的多样性,被誉为天然药物的资源“宝库”,目前海洋微生物已成为世界各国开发新型药物的热点领域。 本文从海洋放线菌的分离、抗MRSA菌株的筛选、菌株的鉴定、发酵条件的优化、活性物质的分离纯化及结构鉴定等几个方面进行了系统研究,结果如下: 采用多种分离培养基与抑制剂,从红树林沉积物中选择性分离放线菌,实验结果表明,以0.005%重铬酸钾为抑制剂的高氏一号合成培养基上生长的放线菌种类最多,且细菌、真菌数量少,最适于分离放线菌。以该培养基作为分离培养基,先后从海南、湛江和北海沿海采集样品75份,采用平板稀释法共分离获得放线菌395株,通过纸片扩散法筛选得到43株有抗MRSA活性的放线菌,其中菌株A115、A209和AM105活性最强且遗传稳定,选择这三个菌株作为目标菌株进行下一步研究。 通过对菌株A115、A209和AM105的形态特征、培养特征、生理生化特征、16SrDNA序列测定及其系统发育分析的研究,鉴定菌株A115为白浅灰链霉菌海洋变种S.albogriseolus var.marine,A209为生金链霉菌S.aureofaciens。AM105与Micromonospora floridensis DSM43907、Micromonospora matsumotoense DSM44100的亲缘关系最近,DNA-DNA杂交率分别为73.5%和53.6%,结果表明AM105应归入M.floridensis。鉴于菌株AM105产生利福霉素,且在形态学、生理生化方面与M.floridensis DSM43907存在较大差异,鉴定放线菌AM105为佛州小单孢菌利福霉素亚种Micromonospora floridensis subsp.rifamycetica,这是佛州小单孢菌产生利福霉素的首次报道。AM105的16S rDNA在GenBank的登录号为AY561829。 研究明确了菌株AM105的最佳发酵工艺和培养基组成。实验考察了碳源、氮源、无机盐、pH值及接种量等对AM105产抑菌活性物质的影响,并通过正交实验对培养基碳氮源进行了优化。确定其最佳培养基组成及发酵条件为:葡萄糖0.5%,淀粉1.5%,大豆粉1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.025%,用50%的天然陈海水与50%的蒸馏水配
论文目录:
摘要
Abstract
1 前言
1.1 抗生素的发展及其抗菌机制
1.1.1 抗生素的发展史
1.1.2 抗生素的分类
1.1.3 抗生素的抗菌机制
1.2 MRSA菌株的产生与抗MRSA抗生素的研究进展
1.2.1 细菌耐药性的产生及其耐药机制
1.2.2 MRSA的产生与现状
1.2.3 MRSA的特点
1.2.4 MRSA耐药的分子机制
1.2.5 抗MRSA抗生素的研究进展
1.3 海洋微生物活性物质的研究进展
1.3.1 海洋微生物
1.3.2 海洋微生物多样性
1.3.3 海洋微生物活性物质研究进展
1.4 本论文研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 主要试剂与溶液
2.2 主要仪器
2.3 供试菌株
2.4 培养基
2.5 海洋放线菌的分离及其抗MRSA菌株的筛选
2.5.1 样品的采集与处理
2.5.2 海洋放线菌的分离
2.5.3 抗菌活性测定
2.5.4 抗MRSA菌株的筛选
2.5.5 活性菌株保存
2.6 放线菌的分类鉴定
2.6.1 形态学特征
2.6.2 生理生化特征
2.6.3 细胞壁化学组份分析
2.6.4 16S rDNA序列测定及系统发育分析
2.6.5 DNA-DNA同源性分析
2.7 放线菌AM105发酵条件的优化
2.7.1 培养条件
2.7.2 测定方法
2.7.3 培养基组成对菌株AM105产活性物质的影响
2.7.4 培养条件对菌株AM105产活性物质的影响
2.7.5 5L罐放大实验
2.8 活性物质的分离纯化与结构鉴定
2.8.1 分离纯化预试验
2.8.2 抑菌活性物质的分离纯化
2.8.3 活性物质AM105-Ⅱ结构鉴定
2.8.4 活性物质AM105-Ⅱ的MIC测定
3 结果与分析
3.1 海洋放线菌的分离及其抗MRSA菌株的筛选
3.1.1 培养基种类的选择
3.1.2 抑制剂的选择
3.1.3 抗MRSA海洋放线菌的分离与筛选
3.1.4 菌株A115、A209与AM105的传代稳定性
3.1.5 活性菌株发酵液的抗菌谱测定
3.2 放线菌的分类鉴定
3.2.1 菌株A115的分类鉴定
3.2.1.1 形态学特征
3.2.1.2 生理生化特征
3.2.1.3 细胞壁化学组份分析
3.2.1.4 16S rDNA序列测定及其系统发育分析
3.2.1.5 菌株A115鉴定结果
3.2.2 菌株A209的分类鉴定
3.2.2.1 形态学特征
3.2.2.2 生理生化特征
3.2.2.3 细胞壁化学组份分析
3.2.2.4 16S rDNA序列测定及其系统发育分析
3.2.2.5 菌株A209鉴定结果
3.2.3 菌株AM105的分类鉴定
3.2.3.1 形态学特征
3.2.3.2 生理生化特征
3.2.3.3 细胞壁化学组份分析
3.2.3.4 16S rDNA序列测定及其系统发育分析
3.2.3.5 菌株AM105与M.floridensis DSM43907、M.matsumotoense DSM44100的比较
3.2.3.6 DNA G+Cmol％含量测定
3.2.3.7 DNA-DNA同源性分析
3.2.3.8 菌株AM105鉴定结果
3.3 菌株AM105发酵条件的优化
3.3.1 培养基组成对菌株AM105产活性物质的影响
3.3.2 培养条件对菌株AM105产活性物质的影响
3.3.3 5L罐发酵放大试验
3.4 活性物质AM105-Ⅱ的分离纯化与结构鉴定
3.4.1 分离纯化预试验
3.4.1.1 稳定性试验
3.4.1.2 有机溶剂萃取试验及溶解性试验
3.4.1.3 Doskochilova纸层析
3.4.1.4 纸电泳
3.4.1.5 薄层层析
3.4.2 活性物质的分离纯化
3.4.2.1 乙酸乙酯萃取
3.4.2.2 硅胶柱层析
3.4.2.3 薄层层析
3.4.2.4 Sephadex LH20柱层析
3.4.2.5 高效液相色谱(HPLC)检测
3.4.3 活性物质AM105-Ⅱ的结构鉴定
3.4.4 活性物质AM105-Ⅱ的抑菌活性
4 讨论
4.1 海洋放线菌的分离
4.2 抗MRSA海洋放线菌的筛选
4.3 分子分类在海洋放线菌多相分类中的应用
4.4 AM105发酵工艺的优化
4.5 活性物质的分离纯化
4.6 利福霉素
5 结论
参考文献
缩略词
附录
致谢
发布时间: 2005-07-27
参考文献
- [1].四株海洋放线菌遗传转化体系的研究[D]. 侯艳华.中国科学院研究生院（海洋研究所）2006
- [2].从胶州湾海洋放线菌中发现的新型星形孢菌素等7种新结构化合物[D]. 吴少杰.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
- [3].不同环境海洋放线菌多样性研究及2株放线菌新菌的分类鉴定[D]. 常显波.中国海洋大学2011
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