水稻条纹病毒NSvc4与两个水稻蛋白的互作研究

论文摘要

近年来,水稻条纹叶枯病在各地爆发流行,给水稻生产造成了严重的损失。该病害是由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起的。RSV编码的蛋白主要有外壳蛋白（CP）、病程相关蛋白（SP）、推测与运动相关的蛋白（NSvc4）等。为了逃避寄主的免疫以及自身的繁殖,病毒蛋白与寄主蛋白之间存在着一系列的互作。在蛋白筛选的基础上,本研究是对病毒蛋白NSvc4与水稻蛋白之间的相互作用做进一步的验证研究。本文首先对免疫共沉淀在水稻蛋白筛选上的应用进行探索。一方面,培养水稻悬浮细胞体系,接种病毒之后提取细胞总蛋白,分别用CP、SP抗体进行免疫共沉淀实验;另一方面,经带病灰飞虱传毒之后,提取发病水稻幼苗总蛋白,分别用SP、CP抗体免疫共沉淀水稻蛋白。分别在水稻悬浮细胞水平和水稻植株水平,筛选与RSV CP、SP蛋白存在相互作用的水稻蛋白。在构建水稻文库（武育粳3号和“KT95-418”）的基础上,分别以RSV CP、SP、NSvc4为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统,筛选出一系列与病毒蛋白存在相互作用的水稻蛋白。本文对以RSV NSvc4为诱饵蛋白,在“KT95-418”文库上筛选到的NB8（Heat shock protein DnaJ family protein contains InterPro domain）、NB9（Light regulated Lir1 family protein contains InterPro domain）蛋白作为对象,对它们之间的相互作用,做进一步的验证研究。首先,提取水稻RNA,通过RT-PCR扩增获得了水稻NB8和NB9完整基因,分别将其与酵母双杂交捕获载体pGADT7相连,构建重组子pGAD-NB8、pGAD-NB9。利用酵母双杂交系统验证了NSvc4分别与NB8、NB9蛋白之间的互作情况。结果发现:RSV NSvc4与NB8在三缺平板,四缺平板上均能正常生长。同样,RSV NSvc4与NB9在三缺平板,四缺平板上也均能正常生长。为了进一步说明水稻条纹病毒RSV NSvc4与水稻蛋白NB8,NB9两两之间的互作关系,本研究又选用免疫共沉淀技术进行检测。首先通过PCR扩增获得了融合有HA标签的水稻NB8、NB9基因和融合有c-Myc标签的RSV NSvc4基因,并将其分别插入到植物表达载体pEGAD或pKYLX71:35S2载体中。重组质粒转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105后注射本氏烟（Nicotianabenthamiana）。提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。结果表明,RSV NSvc4蛋白与NB8能够发生互作,而NSvc4与NB9蛋白之间未检测到互作现象。最后,本研究利用荧光定量PCR技术,对NB8、NB9基因,在水稻病叶和水稻健叶中mRNA表达量的情况分别做了检测。NB8在水稻病叶中mRNA表达量与水稻健叶含量相比较没有明显变化,NB9 mRNA表达量比在健叶中有下降。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的研究概况
• 1.1.1 病害症状
• 1.1.2 RSV基因组结构及功能
• 1.2 酵母双杂交系统及应用
• 1.2.1 酵母双杂交系统简介
• 1.2.2 酵母双杂交系统的应用研究
• 1.2.3 利用酵母双杂交研究植物—病原物的互作
• 1.2.3.1 植物蛋白与病毒复制酶类蛋白之间的相互作用
• 1.2.3.2 植物蛋白与病毒运动蛋白之间的相互作用
• 1.2.3.3 植物蛋白与病毒外壳蛋白之间的相互作用
• 1.2.3.4 植物蛋白与病毒其他蛋白之间的相互作用
• 1.3 免疫共沉淀技术及应用
• 1.3.1 免疫共沉淀技术简介
• 1.3.2 免疫共沉淀技术的应用
• 1.4 荧光定量PCR技术及应用
• 1.4.1 荧光定量PCR简介
• 1.4.2 实时荧光定量PCR荧光探针及应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2.免疫共沉淀技术在筛选水稻蛋白中的探索应用
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试毒源、昆虫
• 2.1.1.2 供试水稻品种
• 2.1.1.3 多克隆抗体、病毒
• 2.1.1.4 试剂及仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 水稻愈伤组织的培养
• 2.1.2.2 水稻悬浮细胞体系的建立
• 2.1.2.3 水稻悬浮细胞活力测定
• 2.1.2.4 水稻悬浮细胞密度测定
• 2.1.2.5 RSV接种水稻悬浮细胞
• 2.1.2.6 荧光抗体染色统计病毒侵染悬浮细胞的百分比
• 2.1.2.7 免疫共沉淀筛选细胞蛋白
• 2.1.2.8 SDS-PAGE
• 2.1.2.9 银染
• 2.1.2.10 常用获毒及传毒方法
• 2.1.2.12 水稻蛋白提取
• 2.1.2.13 免疫共沉淀筛选水稻蛋白
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 愈伤组织的获得
• 2.2.2 水稻悬浮细胞的获得
• 2.2.3 水稻悬浮细胞活性测定
• 2.2.4 免疫共沉淀筛选水稻蛋白
• 2.3 小结与讨论
• 3.利用酵母双杂交系统对互作蛋白再验证
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 实验材料
• 3.1.1.2 菌株和质粒
• 3.1.1.3 PCR引物
• 3.1.1.4 主要试剂
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 水稻叶片总RNA的提取
• 3.1.2.2 RT-PCR扩增
• 3.1.2.3 NB8、NB9目的基因片段的纯化
• 3.1.2.4 PCR扩增产物和pMD18-T克隆载体的连接
• 3.1.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备
• 3.1.2.6 大肠杆菌感受态细胞转化
• 3.1.2.7 重组克隆的PCR筛选
• 3.1.2.8 NB8和NB9基因酵母双杂交载体的构建
• 3.1.2.9 两质粒共转化酵母细胞
• 3.2.结果与分析
• 3.2.1 NB8、NB9基因的扩增和克隆
• 3.2.2 NB8、NB9基因酵母双杂交载体的构建
• 3.2.3 NSvc4和NB8、NB9两蛋白之间的互作检测
• 3.3 小结与讨论
• 4.利用免疫共沉淀技术验证NSvc4与NB8、NB9的互作
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌株和质粒
• 4.1.1.2 PCR引物
• 4.1.1.3 主要试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 目的基因的扩增和克隆
• 4.1.2.2 根癌农杆菌感受态细胞制备
• 4.1.2.3 根癌农杆菌感受态细胞转化
• 4.1.2.4 含有重组质粒单菌落农杆菌鉴定
• 4.1.2.5 植物表达载体在烟草中的瞬时表达
• 4.1.2.6 外源蛋白在烟草中表达情况的检测
• 4.1.2.7 植物蛋白提取
• 4.1.2.8 免疫共沉淀
• 4.1.2.9 SDS-PAGE电泳
• 4.1.2.10 Western blot鉴定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 目的基因的获取和克隆
• 4.2.2 植物瞬时表达载体的构建
• 4.2.3 蛋白互作情况的检测
• 4.3 小结与讨论
• 5.利用荧光定量PCR技术检测NB8、NB9 mRNA表达情况
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 供试材料
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 荧光定量PCR引物的设计
• 5.1.2.2 RNA的抽提和质量检测
• 5.1.2.3 cDNA的合成
• 5.1.2.4 目的基因和内参基因标准曲线的建立
• 5.1.2.5 荧光定量PCR检测不同样品中目的基因的表达量
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 样品总RNA的质量检测
• 5.2.2 目的基因和内参基因的融解曲线
• 5.2.3 目的基因和内参基因的扩增曲线
• 5.2.4 目的基因和内参基因的标准曲线
• 5.2.5 目的基因和内参基因的原始定量
• 5.2.7 目的基因的相对定量
• 5.3 小结和讨论
• 6.展望
• 总结
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 致谢