余甘子抗癌化学物质组分及作用机制研究

论文摘要

目的余甘子Phyllanthus emblica L.为大戟科植物,是藏族习用药材。余甘子有很多药理作用,其中抗癌作用越来越受到各国学者的广泛重视。本文以中药余甘子为研究对象,采用现代分析技术,运用体外药效及体内免疫实验,筛选出藏药余甘子抗肿瘤活性组分,对其物质基础进行研究,初步阐明余甘子化学组分抗肿瘤的作用机制,并对不同产地的余甘子及其提取后的总酚酸、总黄酮进行了主峰的归属,通过本课题对藏药余甘子的研究,为开发新的抗癌活性药物提供了科学依据。方法采用血清药理学,血浆药理学方法对余甘子不同醇提取物进行初步筛选。用余甘子水提物,余甘子70%乙醇提取物,余甘子95%乙醇提取物分别给昆明种小鼠灌胃后取血清、血浆,并将其作用于不同肿瘤细胞,使用MTT显色法,检测余甘子提取物含药血浆和含药血清对不同癌细胞株的抑制率,并对血浆药理学,血清药理学实验结果进行了对比。采用紫外分光光度法对余甘子总酚酸、余甘子总黄酮进行含量测定。采用高效液相色谱法对不同产地的余甘子中没食子酸进行了含量测定,并采用大孔吸附树脂法对余甘子总酚酸、总黄酮进行了纯化工艺研究。通过体外细胞MTT法检测余甘子总酚酸、总黄酮对肝癌细胞、宫颈癌细胞的抑制作用,对其体外药效学进行了初步研究。采用基线等比法设计原理,用MTT法对余甘子总酚酸,总黄酮进行抗肿瘤的配伍研究。用基线等比法设计原理,将总酚酸,总黄酮按不同比例,给小鼠灌胃取血清,并用小鼠血清IL-2 ELISA试剂盒,小鼠血清IFN-γELISA试剂盒,进行试验,测定了余甘子对肿瘤细胞抑制作用及免疫调节的作用。通过细胞抑制作用和免疫调节作用结合,对配伍结果进行分析,得到总黄酮、总酚酸的剂型配伍比例。采用HPLC法,梯度洗脱对余甘子提取物纯化后的总酚酸和纯化后的总黄酮的指纹图谱进行研究,目的是比较不同产地的余甘子成分的差异,建立以没食子酸,芦丁为代表的余甘子提取物的HPLC指纹图谱,为有效控制余甘子内在质量提供理论依据。通过流式细胞仪PI单标检测细胞周期。药物能阻止细胞的无限增殖,使细胞阻止在G1期（即D NA合成前期）或S期（DNA合成期）或G2期（DNA合成后期）。本试验通过流式细胞仪检测总酚酸和总黄酮作用于细胞并检测其阻止时期。结果1.通过用余甘子水提物、余甘子70%乙醇提取物、余甘子95%乙醇提取物给小鼠灌胃后分别取血清血浆作用于不同癌细胞,测定OD值,得到抑制率。结果发现余甘子70%乙醇提取物的血浆整体对癌细胞的抑制率较高。2.实验结果发现余甘子70%乙醇提取物的含药血浆对肝癌细胞和宫颈癌细胞的抑制率较好。最终选定本实验以余甘子抗肝癌和宫颈癌为主要研究目标。3.采用紫外分光光度法对余甘子水提物、余甘子70%乙醇提取物、余甘子95%乙醇提取物的总黄酮和总酚酸进行含量测定。总酚酸的含量分别为266.00mg/g、247.20mg/g、86.40mg/g。总黄酮的含量分别为56.58mg/g、59.52mg/g、54.30mg/g。通过综合比较70%乙醇提取物,总酚酸和总酚酸含量都相对比较高。4.采用高效液相色谱法对不同产地的余甘子中没食子酸进行含量测定,实验结果表明：福建产地的余甘子中没食子酸含量最高,每克生药材中百分含量为1.634%。5.采用大孔吸附树脂对余甘子提取物中总酚酸进行纯化工艺研究,确立工艺路线为选用聚酰胺树脂,洗脱剂为水,洗脱体积为6倍柱体积,树脂柱的径高比为1：5,流速为1.5mL/min。6.用大孔吸附树脂对余甘子提取物中总黄酮进行纯化工艺研究,确立纯化工艺路线为选用聚酰胺树脂,洗脱剂为50%乙醇,洗脱体积为7倍柱体积,树脂径高比为1：5,流速为1mL/min。7.余甘子纯化后总酚酸作用于肝癌细胞SMMC-7721,宫颈癌细胞Hela的时效曲线,最高抑制率为83.9%和92.9%。8.余甘子纯化后总黄酮作用于肝癌细胞SMMC-7721,宫颈癌细胞Hela的时效曲线,最高抑制率为66.1%和88.5%。9.通过体外实验进行配伍研究,得到余甘子抗癌制剂余甘子总酚酸和总黄酮配伍比例为34.56μg:34μg时抗癌效果最好。为更进一步确定配伍比例,又做了体内动物实验的免疫学研究,及对总酚酸抗氧化性质的说明,辅助对配伍结果的解释,实验结果表明余甘子总酚酸和总黄酮均能提高机体免疫力。10.通过高效液相色谱法对不同产地的余甘子进行的产物总酚酸和总黄酮进行指纹图谱研究,结果证明不同产地的余甘子质量均一,稳定。11.通过用流式细胞仪对凋亡细胞进行细胞周期测定,余甘子能使癌细胞发生S期阻滞,影响细胞周期正常进程,与细胞凋亡有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 藏药余甘子的文献研究综述
• 第一节 余甘子的本草考证
• 第二节 余甘子化学成分研究进展
• 第三节 余甘子药理作用研究进展
• 第四节 余甘子抗肝癌作用机制研究
• 参考文献
• 第二章 余甘子抗癌化学物质组的活性筛选及纯化研究
• 第一节 含药血清对肿瘤细胞抑制作用的筛选
• 第二节 含药血浆对肿瘤细胞抑制作用的筛选
• 第三节 大孔吸附树脂纯化余甘子总酚酸的工艺研究
• 第四节 大孔吸附树脂纯化余甘子总黄酮的工艺研究
• 第五节 分析讨论
• 第三章 化学物质组组分分析
• 第一节 余甘子提取物中没食子酸的含量测定
• 第二节 对余甘子中不同提取方法的提取物总酚酸含量测定
• 第三节 对余甘子中不同提取方法的提取物总黄酮含量测定
• 第四节 分析讨论
• 第四章 不同产地余甘子总酚酸和总黄酮的指纹图研究
• 第一节 余甘子总酚酸指纹图谱研究
• 第二节 余甘子总黄酮的指纹图谱研究
• 第三节 分析讨论
• 第五章 余甘子有效化学物质组体内外药效学研究
• 第一节 余甘子纯化后的总酚酸及总黄酮体外药效学研究
• 第二节 余甘子提取物及其纯化后的酚酸的抗氧化性研究
• 第三节 余甘子中总黄酮和总酚酸抗癌效果的配伍研究
• 第四节 余甘子中总黄酮和总酚酸免疫调节效果的配伍研究
• 第五节 分析讨论
• 第六章 余甘子总酚酸和总黄酮抗肝癌作用机制的初步研究
• 第一节 余甘子总酚酸抗肝癌作用机制的初步研究
• 第二节 余甘子总黄酮抗肝癌的作用机制的初步研究
• 第三节 分析与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历