丙型肝炎病毒新型DNA疫苗的免疫原性优化策略研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（HCV）是导致输血相关性和社区获得性肝炎的主要病原,感染者中大约70%发展为慢性肝炎,其中20%-30%进展到肝硬化,所有感染者罹患肝癌的风险增加。目前,唯一可用疗法是干扰素（IFN-α）单独或与利巴韦林联合使用,治疗费用昂贵,治愈率较低,可能产生严重的副作用。因此,发展一种抗丙型肝炎病毒的疫苗是目前控制HCV感染的有效策略。研究表明,HCV感染的有效的预防与清除,需要强有力的和持久的T细胞介导的特异性免疫应答。在临床前研究中,DNA免疫已经成为一种能够诱导保护性T细胞免疫反应的有效和安全的疫苗研发策略。然而,在非人灵长类动物实验和人体试验中,DNA疫苗的免疫原性远不及其在小鼠试验中所表现出的强度。近来有一些提高DNA疫苗免疫原性的策略被应用到动物实验中,包括采用电转的方式提高DNA的摄入量和靶蛋白表达,融合表达抗原和功能蛋白以改善抗原特异性递呈,联合应用免疫刺激剂和分子佐剂以提高免疫应答水平等。HCV实验性DNA疫苗的研究已有大量报导,并有几种疫苗进入临床试验。但其人群应用的障碍主要为免疫原性不理想。为研发新型HCV DNA疫苗并探讨优化其免疫原性的策略,本研究选取文献报道中已证实的在HCV感染清除中具有重要作用的靶抗原,包括结构蛋白（核壳蛋白C,包膜蛋白E1与E2）与相对保守的非结构蛋白3（NS3）,应用复制型（pSCK）或非复制型（pVRC）质粒DNA疫苗载体,分别构建了几种能够表达NS3与Core的融合蛋白、E1E2蛋白、NS3及NS3与DEC205融合蛋白的DNA疫苗,瞬时转染鉴定其表达,采用直接注射或注射结合电转的方式免疫Balb/C小鼠,对其体液与细胞免疫效果进行研究,从而为研发新型HCV DNA疫苗并优化其免疫原性提供依据。主要研究结果如下：1.为比较蛋白疫苗与DNA疫苗在小鼠中的免疫应答特点,同时优化免疫程序及评价电转对DNA疫苗免疫原性的影响,我们构建了NS3与Core融合蛋白的HCV DNA疫苗表达质粒,瞬时转染293T细胞后通过Western blot鉴定其表达,将该DNA疫苗质粒采用肌肉注射和皮内注射两种方式免疫小鼠,分别结合不同电转方式（2针阵列式电极电转或卡钳式电极电转）来提高免疫原性；以C44P蛋白疫苗肌肉注射免疫组为对照；通过ELISA和ELISPOT检验不同HCV疫苗的体液免疫和细胞免疫应答。结果表明：DNA疫苗免疫各组诱发的细胞免疫反应均强于蛋白疫苗组,DNA疫苗各组中肌肉注射组结合2针阵列式电极电转组要强于单独肌肉注射组,皮内注射结合卡钳式电极组要强于皮内注射结合2阵阵列式电极组,各质粒注射产生的抗体亚型以lgG1型为主。2.为比较分析基于复制型载体pSCK与常规应用的非复制型载体pVRC的HCV DNA疫苗的免疫原性,分别采用表达包膜蛋白的pVRC-JFH1-E1E2、pVRC-HeBei-E1E2、pSCK-HeBei-E1E2质粒免疫小鼠,应用基于HeBei株包膜蛋白序列的特异性肽段或肽库进行的ELISPOT检测结果表明：基于复制型载体构建的DNA疫苗诱导产生的特异性IFN-γ高于非复制型载体构建的DNA疫苗,且其中皮内注射结合卡钳电极组产生的反应最强。以保守的肽段作为检测抗原进行ELISA分析特异性抗体应答,上述各组诱发产生的IgG滴度均低于1：50。3.为进一步评价新型树突状细胞靶向的分子佐剂（DEC205单链抗体分子）对HCV DNA疫苗免疫原性的增强作用,我们构建了融合表达DEC205单链抗体分子与HCV NS3的DNA疫苗质粒pVRC-DEC-NS3,通过瞬时转染293细胞鉴定其表达,然后采用皮内注射结合卡钳电极电转的方式二针快速免疫小鼠,另设一组以同样方式注射质粒pVRC-DEC和pVRC-NS3的混合物,结果表明：对于pVRC-NS3单独免疫或者同pVRC-DEC共同免疫,无论是体液免疫方面还是细胞免疫方面应答水平均较低,但是采用NS3和DEC205的融合蛋白表达质粒pVRC-DEC-NS3免疫则免疫原性显著增强。综上所述,以HCV结构蛋白Core、E1、E2为靶抗原或者非结构蛋白NS3为靶抗原构建的新型DNA疫苗免疫小鼠,均可诱发特异性细胞免疫应答；应用电转技术有助于提高HCV DNA疫苗的免疫原性,使用皮内注射结合卡钳电极的注射方案诱导产生的细胞免疫反应最强；基于复制型载体构建的DNA疫苗诱导产生的特异性IFN-γ高于非复制型载体构建的DNA疫苗,并可降低疫苗应用剂量；HCV非结构蛋白NS3与DEC205单链抗体分子融合表达构成的DNA疫苗（pVRC-DEC-NS3）免疫后诱导的靶抗原特异的体液与细胞免疫应答明显强于非融合的HCV NS3 DNA疫苗（pVRC-NS3）。上述研究结果为新型HCV DNA疫苗（也包括其他病毒性疾病DNA疫苗）的研发及优化应用提供了重要的科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 第一部分 电转对表达丙型肝炎病毒NS3和Core融合蛋白的DNA疫苗免疫原性的影响
• 1 DNA疫苗的构建和鉴定
• 2 动物免疫方案
• 3 体液免疫反应水平的检测
• 4 细胞免疫反应水平检测
• 小结
• 第二部分 不同载体对表达丙型肝炎病毒E1和E2蛋白的DNA疫苗免疫原性的影响
• 1 DNA疫苗的表达鉴定
• 2 动物免疫方案
• 3 体液免疫反应水平检测
• 4 细胞免疫反应水平检测
• 小结
• 第三部分 靶向DC的分子（DEC 205单链抗体）与靶抗原（丙型肝炎病毒NS3）融合对DNA疫苗的免疫原性的影响
• 1 DNA疫苗的构建
• 2 DNA疫苗的表达鉴定
• 3 动物免疫方案
• 4 体液免疫反应水平检测
• 5 细胞免疫反应水平检测
• 小结
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 硕士在读期间论文发表