人脂联素球状结构域（gAd）基因的克隆、表达、纯化及活性的测定

论文摘要

目的构建gAd 原核表达体系并对培养条件进行优化,对目的蛋白分离、纯化、复性并测定其生物活性;同时构建gAd 融合蛋白表达体系,完成对融合蛋白的纯化。方法本研究首先分离健康人外周血淋巴细胞,用酚-氯仿法抽提基因组DNA,从Genbank 获取脂联素的基因序列,用Oligo 6.44 软件设计引物,使其扩增产物中包含脂联素球状结构域基因全部序列,PCR 产物用低熔点琼脂糖凝胶切胶回收纯化,纯化的扩增产物和T 载体的连接,连接产物转化JM109感受态细胞,在氨苄阳性平板中筛选白色菌落,扩种后提取质粒用酶切和PCR 鉴定,该质粒命名为pMD18T-Ad。以pMD18T-Ad 为模板,设计合适引物,在上游引物中加入EcoR I 酶切位点和起始密码,在下游引物中加入终止密码和Pst I 酶切位点,把上述扩增产物经切胶回收纯化后与pBV220 经EcoR I 和Pst I 双酶切纯化后的产物连接,把该质粒命名为pBV220-gAd,转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性菌株,并经测序进一步证实,温控诱导表达,超声破菌,包涵体的分离洗涤纯化复性。复性后用超滤管离心浓缩,0.22μm 微孔滤膜过滤除菌,用考马斯亮蓝法测定蛋白含量,把一定量的gAd注入高糖和高脂肪酸的兔体内,不同时间采血观察其降低血糖和游离脂肪酸的效果。以pBV220-gAd 为模板通过PCR 方法构建C 端含有His Tag 的pBV220-gAdhis 质粒并转化大肠杆菌DH5α,用Western-blotting 鉴定,用Ni2+-NTA 树脂柱对对表达产物进行纯化。

论文目录

• 前言
• 第一章 gAd 的生物活性和分子结构
• 1.1 gAd 的生物活性
• 1.2 gAd 的分子生物学结构
• 第二章 pBV220-gAd 原核表达载体的构建思路
• 2.1 gAd 因子的cDNA 酶切位点分析
• 2.2 pBV220-gAd 原核表达载体的构建思路
• 第三章 gAd 的原核表达载体的构建
• 3.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章 gAd 的原核表达条件的研究
• 4.1 材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 第五章 gAd 生物学活性的测定
• 5.1 材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.5 结论
• 第六章 gAd 的原核融合表达及产物的纯化
• 6.1 材料
• 6.2 实验方法
• 6.3 结果
• 6.4 讨论
• 6.5 结论
• 参考文献
• 综述
• 个人简介
• 致谢