论文摘要
大白菜温敏雄性不育系在杂种优势利用中占有十分重要的地位,但温度调控育性转化的机理尚不清楚。本研究采用cDNA-AFLP技术和蛋白质双向凝胶电泳技术从转录和表达两个水平对大白菜温度敏感雄性不育系进行了温度调控育性转化机理的探究,分析了来自同一遗传背景,在不育和可育条件下幼蕾的基因转录（幼蕾≤1.0㎜,包括顶端分生组织）和表达（约1.5㎜幼蕾）的差异。探究了大白菜温敏雄性不育系幼蕾发育过程中,温度调控育性转化的机理。获得的主要研究结果如下:1.建立了一套适合大白菜转录水平差异分析的cDNA-AFLP技术。该方法是将提取的大白菜幼蕾RNA,经cDNA一链合成试剂盒反转录合成cDNA一链,再采用DNA polymeraseⅠ和RNase H以适当的比例和反应时间合成cDNA二链,将合成的cDNA二链作为模板进行AFLP分析。利用该技术合成的cDNA二链质量较高,差异显示分析表明该技术具有稳定性好、假阳性低、所需RNA少等优点。2.利用建立的cDNA-AFLP技术,分析了温敏型大白菜细胞质雄性不育系TsCMS7311低温处理期间及处理后幼蕾（≤1.0㎜,包括顶端分生组织）中的基因转录水平的差异。用256对引物扩增出连续性差异片段212条,其表现归为2类4种差异带型,其中以诱导带型产生为主,有175条差异带,表现为“无→有→无”和“无→有”2种带型;诱导沉默带型37条,包括“有→无→有”和“有→无”2种带型。3.对差异片段进行回收、克隆、测序,共得到100条EST序列,其大小为100-700bp。经BLASTx序列比对分析发现, 34条EST序列与已知蛋白相似性大于62%,表明温度调控育性的转化与新陈代谢、能量、防御、细胞构建、蛋白质合成及运输、转录翻译、细胞通信及信号转导等相关蛋白有关;有49条EST序列与已知表达序列标签有很高相似性,一致性均达到了90%以上,且47条同源EST来源于芸薹属; 17条EST序列在两个库中没有找到与之同源的序列,或相似性很低,无法进行分析,推测可能是一些新的基因片段,并将其中的3条长于150bp的EST登录GeneBank,获得的登录号分别为: EST80:登录号FE905220, dbESTId 54764252; EST182:登录号FE905221, dbESTId 54764253; EST162:登录号FE905222, dbESTId 54764254。4.对EST-58, EST-114和EST-188三个ESTs进行了电子克隆,并通过RT-PCR验证,获得了2个大白菜新基因——大白菜木葡聚糖内糖基转移酶EXT基因（登录号:EU579461）和大白菜酪氨酸磷酸酯酶样蛋白PAS基因（登录号:EU650783）,一个伸长的EST188,在GeneBank登录（登录号为:FE905223;dbESTId:54764255）。对EST-58的电子延伸得到了长1196bp的新生序列,RT-PCR验证结果表明与电子克隆的结果一致性达98%,该序列具有完整的阅读框架,编码292 AA,同源比对分析得知该序列是新的大白菜木葡聚糖内糖基转移酶EXT基因。对EST-114的电子延伸得到了长1036bp的新生序列,RT-PCR验证结果表明与电子克隆的结果一致性达98%,该序列具有完整的阅读框架,编码229 AA,同源比对分析得知该序列是新的大白菜酪氨酸磷酸酯酶样蛋白PAS基因。对EST-188的电子延伸得到了长877bp的新生序列,RT-PCR验证结果表明与电子克隆的结果一致性达96%,但该序列阅读框架不完整,作为EST递交了GeneBank。5.建立了一套有效的大白菜特异β-酯酶的回收、纯化方法。即采用制备型电泳与切胶回收相结合的技术对目的β-酯酶进行富集,自制双向电泳系统进一步分离纯化。制备型凝胶两边染色,切割回收中间未染色的目的条带区。通过电洗脱及冷冻干燥的方法得到目的酯酶的粗干粉,然后再经过自制双向凝胶电泳系统进一步分离纯化。该系统双向凝胶电泳的第一向是等电聚焦电泳,采用国产竖直板电泳槽进行,既经济又高效。第二向是SDS电泳,即等电聚焦电泳完毕进行考马斯亮兰蛋白染色,切下目的条带,直接进行SDS电泳再分离,减少了非目的条带对分析的干扰,使分析结果更可靠。6.获得了特异β-酯酶多肽的部分氨基酸序列。通过双向凝胶电泳的分离纯化,共获得了与育性转化相关的6种多肽,对其中分子量为57.1KD和62KD的两个多肽进行Q-TOF质谱测序,分别得到了3段短肽序列和2段短肽序列。并且分子量为62KD的目的条带测出的2段短肽序列与分子量为57.1KD中的两段短肽序列完全相同,预示着两条肽链氨基酸序列相似性很强。7.将获得的3段短肽序列同源比对,分析发现它们与p27SJ蛋白有很高的序列一致性（60-100%）。