肝细胞肝癌患者尿液的代谢组学研究

论文摘要

目的：代谢组学方法已经广泛应用于血清、血浆、组织、以及各种生理体液中,其中不乏脑脊液、腹水、尿液等样品。在这些样品中,尿液因含有大量机体排出的代谢产物,而且可无创性获取而成为科学家们研究的热点。本研究拟以高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC/MS）技术为基础,建立无创性的尿液代谢组学实验方法,并对肝癌的代谢指纹图谱进行全面分析,以指导疾病诊断和疗效评估。因此,我们采用该理论,结合现代生物质谱技术,在整体水平上分析了临床肝癌、肝硬化病人与正常对照人群的尿液代谢谱差异,对乙肝所致的肝癌、肝硬化患者尿液进行代谢组学研究,探索将代谢组学方法应用于临床疾病机制研究的新思路。方法：（1）建立生物样本的前处理方法。在生物样本（本文主要指尿液）中影响最大的是蛋白质,若用色谱法测定时蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞,严重影响分离效果,本文通过实验筛选建立了尿液的前处理方法。首先将尿液在15000rpm下离心沉淀蛋白,然后尿液上清与含0.1%的色谱纯乙腈的纯水按1：4（V/V）混合离心,上清直接进行HPLC/MS。（2）建立以HPLC/MS为基础的肝癌尿液代谢组学平台,探讨HPLC/MS技术在肝癌早期诊断中应用的可行性,并通过肝癌患者的尿样代谢物的变化来推测与肝癌相关的代谢通道的变化,同时寻找与肝癌病变稳定相关的代谢物的变化规律。利用HPLC/MS技术检测正常人和乙型肝炎引起的肝硬化尿液代谢组学的变化,从而进行肝癌、肝硬化和正常对照组的代谢谱的鉴别诊断。结果：（1）采用有机溶剂沉淀法的尿液前处理步骤相对简单,且不影响分析结果,可获得足够的灵敏度,对仪器系统污染也小,可作为尿液代谢组研究的常规稀释条件。（2）初步建立了以HPLC/MS技术为基础的肝癌尿液代谢谱。对肝癌组和正常组尿液代谢谱进行对照分析,并经数据库鉴定,获得11个内源性代谢物。酪氨酸、谷氨酸等氨基酸在肝癌组中显著升高,甘氨酸、亮氨酸等显著减少,部分脂类也发生显著变化。对HCC组和肝硬化组代谢谱进行对照分析,并经数据库鉴定,获得6个内源性代谢物,发生变化的主要是白三烯和尿胆素原等。应用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）方法,发现三组样本能完全聚类,因此得出初步结论,可利用代谢组学技术对正常人与肝硬化、肝癌患者进行鉴别诊断。结论：通过对正常人、肝硬化和肝癌的尿液代谢组学研究,发现某些代谢标志物能够部分揭示肝癌发生发展的病理机制,具有较高的疾病诊断价值和-定的疗效评估能力。代谢组学作为现代生命科学的一个新的分支,对研究肝脏疾病的发病机制和指导临床诊治有重要价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象和方法
• 1.1 对象
• 1.1.1 病例组
• 1.1.2 对照组
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 质谱条件
• 1.4.2 色谱条件
• 1.4.3 尿样的前处理
• 1.4.4 数据的处理方式和模式识别
• 结果
• 2.1 尿液两种前处理方法的摸索结果
• 2.2 肝癌患者血清与尿液的TIC图
• 2.3 肝癌、肝硬化患者与正常人HPLC/MS分析的TIC图
• 2.4 多维统计分析
• 2.5 差异变量的研究
• 2.6 差异代谢物的分析
• 2.6.1 肝癌患者和正常人尿液中的差异代谢物
• 2.6.2 肝癌和肝硬化患者尿液中的差异代谢物
• 讨论
• 3.1 样品的前处理及条件摸索
• 3.2 尿液代谢组学
• 3.2.1 胆汁酸代谢
• 3.2.2 氨基酸代谢
• 3.2.3 脂类代谢
• 3.2.4 核苷酸代谢
• 3.2.5 胆色素代谢
• 3.2.6 三羧酸循环
• 3.2.7 维生素代谢
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 代谢组学技术及其在肝脏疾病中的应用
• 参考文献
• 致谢