PICK1基因敲除对炎性疼痛的作用及相关机制

论文摘要

第一部分PICK1基因敲除对炎性痛觉行为学的影响目的：PICK1（蛋白激酶Cα相互作用蛋白1，protein interacting with Cαkinase 1）是从线虫到人的所有生物中非常保守的一类存在于细胞质中的膜结合蛋白，自1995年被发现以来，已报道能与20多种蛋白发生相互作用。PICK1在人和动物的组织和细胞内均可表达，广泛分布于机体的各种组织。PICK1参与一些疾病的发生，如：癌症、精神分裂症、疼痛、帕金森综合症等。虽然PICK1在这些疾病发生过程中的具体作用机制现在还不清楚，但其广泛的结合特性使其可能通过与疾病相关蛋白的相互作用进而在疾病发生过程中扮演一定角色。炎症是一种常见的病理情况，在组织炎症时，病变部位可产生慢性持续性疼痛和痛觉过敏，不仅使患者感到不适或痛苦，并且可造成诸多生理功能障碍和精神疾病，如睡眠失调、抑郁症、注意力下降等。已有研究显示PICK1基因敲除小鼠对机械性刺激反应减弱，但其对炎性疼痛的影响还不清楚。本实验的目的就是观察PICK1基因敲除后小鼠炎性痛觉行为是否改变。方法：应用PICK1基因敲除小鼠，皮下注射4％福尔马林溶液造成炎性疼痛模型，与同窝野生型小鼠对比，观察炎性痛觉行为的变化情况。结果：PICK1基因敲除后，其炎性痛觉行为学发生明显变化，表现为对炎性疼痛更加耐受。1．PICK1基因敲除对头面部炎性痛觉行为学的影响。单侧面部触须垫皮下注射4％福尔马林溶液后，与同窝野生型小鼠比较，PICK1基因敲除小鼠每3 min时间内用同侧前肢或后肢摩擦注射部位的行为明显减少。2．PICK1基因敲除对足部炎性痛觉行为学的影响。（1）采用热板法测小鼠基础痛阈，发现与同窝野生型小鼠比较，PICK1基因敲除小鼠基础痛阈值明显增高。（2）单侧足背皮下注射4％福尔马林溶液后，与同窝野生型小鼠比较，PICK1基因敲除小鼠痛阈值明显增高。结论：1．PICK1基因敲除小鼠对福尔马林导致的面部炎性疼痛的两期耐受性均增加，即不仅对第一相的急痛反应耐受性增加，对炎症反应所导致的第二相中枢敏感化也有抑制作用。2．PICK1基因敲除小鼠单侧足背皮下注射4％福尔马林溶液前后对热刺激引发的缩足反应时间均明显延长，提示PICK1基因敲除对生理性和炎性热敏性疼痛耐受性均增强。第二部分PICK1基因敲除对TG、DRG和脊髓背角ASICs通道功能和表达的影响目的：酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是ENaC／DEG（epithelial Na+channel／degenerin）通道超家族的成员之一，能被细胞外pH下降或H+浓度上升直接激活。它广泛分布于中枢及外周神经系统的神经元，参与了很多重要的生理过程和病理反应，与学习记忆、突触可塑性、脑缺血、疼痛等关系密切。H+激活ASICs可使神经元去极化，产生动作电位，参与了组织酸化如缺血、炎症、肿瘤、癫痫等时痛觉的感受。由中度pH降低所诱发的皮肤表面酸诱导疼痛主要是由ASICs介导的，而更强的酸化引起的疼痛则是ASICs和TRPV1共同参与。目前已克隆出的ASICs主要有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。PICK1通过其PDZ结构域与ASIC1和ASIC2相互作用，对ASICs功能的发挥起到重要作用，但PICK1与外周和中枢感觉神经元ASICs之间具体作用如何以及有何意义?在上文中我们已经证实PICK1基因敲除小鼠对炎性疼痛的耐受性增强，它的具体机制是什么?是否与ASICs有关?这些都值得我们去进一步探讨。方法：采用western blotting、全细胞膜片钳、钙影像技术和免疫荧光组织化学技术，观察PICK1基因敲除前后，外周初级感觉神经元和脊髓背角上ASICs的蛋白表达和功能的变化情况，探讨可能的机制。结果：PICK1基因敲除后AISC1的功能和蛋白表达均降低而AISC3的功能和蛋白表达均无变化。1．PICK1基因敲除小鼠TG神经元上AISC1电流幅度减小，全细胞膜片钳结果显示野生型AISC1电流幅度为2．37±0．46nA，PICK1基因敲除后AISC1电流幅度减少为1．21±0．35 nA（n=7，p＜0．05 vs wild type）。PICK1基因敲除小鼠TG神经元上通过ASIC1通道诱导的胞内钙升高减少。将细胞外液由pH 7．4迅速转换成pH 6．0时，野生型△[Ca2+]／[Ca2+]比值为0．218±0．034（n=11 from 2 animals），纯合子为0．131±0．020（n=10 from 2 animals，p＜0．05 vs wild type）。将细胞外液由pH 7．4迅速转换成pH5．0时，野生型△[Ca2+]／[Ca2+]比值为0．818±0．204 （n=18 from 3 animals），纯合子为0．379±0．091 （n=18 from 4 animals，p＜0．01 vs wild type）。2．PICK1缺失造成的ASIC1功能损伤可能是由于ASIC1蛋白表达总量的减少所致，使其在细胞内的分布均匀减少，但其亚细胞定位并无改变。Western blotting和免疫荧光的结果均显示，小鼠TG、DRG和脊髓背角上ASIC1蛋白表达总量和荧光强度均减少，但分布并未改变，仍在细胞膜上和胞浆内均匀分布（n=6）。3．PICK1基因敲除小鼠TG神经元上ASIC3和TRPV1的表达和功能无变化。膜片钳实验结果显示：PICK1基因敲除小鼠TG神经元上ASIC3和TRPV1电流幅值均无明显变化（ASIC3：WT 2．59±0．41nA vs KO 2．43±0．39 nA，n=8，P＞0．05；TRPV1：WT 1314±268．3pAvs KO 1256±272．4pA，n=4，p＞0．05）；Western blotting和免疫荧光的结果均显示，小鼠TG、DRG上无论是ASIC3还是TRPV1的蛋白表达量都未发生改变；ASIC3和TRPV1在细胞膜上和胞浆内均匀分布（n=6 for ASIC3 and n=3 forTRPV1）。结论：1．PICK1基因敲除造成ASICs的功能损伤。PICK1基因敲除小鼠TG神经元上AISC1电流幅度减小，通过ASIC1通道诱导的胞内钙升高减少。根据不同ASIC亚单位的分布和特性，推测这一作用主要是通过ASIC1a同聚体来实现，而与TRPV1和ASIC3无关。2．PICK1缺失造成的ASICs功能损伤可能是由于ASIC1蛋白表达总量的减少所致，使其在细胞内的分布均匀减少，但其亚细胞定位并无改变。第三部分PICK1对炎性痛时ASICs的作用及相关机制目的：炎性疼痛的产生一是由于一些致痛物质的释放，如缓激肽、前列腺素、P物质、降钙素基因相关肽等；另一方面，由于炎症局部pH降低，可激活外周伤害感受器，引起伤害性感受器神经元产生失活速率较慢的长时程去极化，促使痛觉过敏的产生。在外周炎症模型中，脊髓背角神经元中ASIC1a蛋白表达明显增加，抑制其表达可产生明显镇痛效果。在神经系统，PICK1通过其特有的PDZ区域与PKCα结合，一方面可以促进PICK1的定位和作用发挥，另一方面，PICK1在PKC功能的发挥中也有重要作用。与PKC相同的是，PKA对ASICs功能的调节作用也需要PICK1来介导。我们通过行为学实验已经证实，PICK1基因敲除小鼠对福尔马林导致的面部炎性疼痛和足部炎性热敏性疼痛耐受性均增加，但是其具体机制还不是很清楚。前面实验结果提示PICK1基因的缺失会影响生理情况下ASICs蛋白表达、细胞定位、电流幅度以及钙的释放，那么，在炎症时PICK1对ASICs的作用是怎样的?是否参与了PICK1对炎性痛觉行为学的作用?除了ASICs外一些炎性致痛物质和PKA、PKC是否也参与了PICK1对炎性痛觉行为学的作用?这些也值得我们去进一步探讨。方法：采用整体动物实验和免疫荧光组织化学技术，观察PICK1基因敲除前后，ASICs、PKA、PKC、SP、CGRP的表达和分布情况，探讨PICK1影响炎性痛觉行为学可能的机制。结果：1．福尔马林造模后，野生型小鼠TG、DRG和脊髓背角的ASIC1和ASIC3表达均明显增加。PICK1基因敲除后，与野生型相比，这些部位ASIC1表达增加被明显抑制，但ASIC1在细胞内的分布并未改变，仍在细胞膜上和胞浆内均匀分布。PICK1基因敲除对ASIC3的表达增加无抑制作用。2．4％福尔马林皮下注射后，野生型小鼠TG、DRG SP表达明显增强，同时PICK1敲除小鼠TG、DRG上SP表达较野生型小鼠明显减少。与之不同的是，在单纯比较对照组时我们在PICK1敲除小鼠TG、DRG上并未发现CGRP含量的变化，却发现其脊髓背角CGRP含量减少。3．给予4％福尔马林皮下注射后，小鼠TG、DRG和脊髓背角PKC和PKA的荧光强度均明显增强，PICK1敲除后PKC的增强作用被取消而PKA的荧光强度无变化。结论：1．给予4％福尔马林皮下注射后，小鼠TG、DRG和脊髓背角ASIC1和ASIC3的表达均增加。不论是生理情况还是炎症时，PICK1基因敲除可减少TG、DRG和脊髓背角ASIC1的表达和分布，但是PICK1缺失对ASIC3的表达和分布无影响。2．4％福尔马林皮下注射后，小鼠TG、DRG SP的含量明显增加，而PICK1敲除可取消炎症时的SP含量增加。3．给予4％福尔马林皮下注射后，小鼠TG、DRG和脊髓背角PKC和PKA的表达均明显增加，PICK1敲除后PKC的增强作用被取消而PKA无变化。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 PICK1基因敲除对炎性痛觉行为学的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 小结
• 第二部分 PICK1基因敲除对TG、DRG和脊髓背角ASICs通道功能和表达的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 小结
• 第三部分 PICK1对炎性痛时ASICs的作用及相关机制
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 小结
• 全文总结
• 综述
• 附录 博士期间发表及待发表文章
• 致谢