转谷氨酰胺酶的分离纯化及膜固定化的研究

论文摘要

本文对转谷氨酰胺酶的分离纯化、分子修饰（制备交联酶晶体）、酶晶体的固定化及各部分酶学性质进行了研究。对购买的转谷氨酰胺酶,通过乙醇沉淀、盐析、超滤、凝胶层析4步纯化,最终获得电泳纯的酶。以酶活力为指标,对转谷氨酰胺酶的分离纯化条件进行了研究,研究结果为：硫酸铵饱和度选为65%时可以将酶蛋白完全沉淀出来,超滤压强为0.2MPa时可以通过超滤膜截留80.2%的酶蛋白,Sephadex G-100层析的洗脱流速为1mL/min,洗脱60min后可收集到酶活力较高的酶液。经测定纯化后转谷氨酰胺酶：酶被纯化了10.42倍,酶活回收率27.3%,比活力达到107.86U/mg。并对转谷氨酰胺酶的酶学特性进行了初步研究,结果表明：转谷氨酰胺酶最适温度和最适pH值分别为为40℃,6.0。酶的热稳定性在30～40℃之间良好,酶的pH值稳定范围在5～7之间,此外,Ca2+、Mg2+、Ba2+对转谷氨酰胺酶几乎没有影响,而Fe3+、Zn2+、Cu2+对酶的活性有所抑制,其中,Fe3+对酶活的影响最大,在应用中要避免。为了进一步提高酶的稳定性,采用采用气相扩散法将纯化后的转谷氨酰胺酶制备成晶体,在将制备好的晶体采用双功能试剂戊二醛进行化学交联。并对得到的交联酶晶体的酶学稳定性进行了研究。实验结果表明,结晶的最优条件为：沉淀剂的浓度为50%,结晶液pH为8,结晶时间为5天,温度为4℃,酶浓度为12mg/ml。交联的最优条件：戊二醛浓度为1%,交联pH为6,交联温度为4℃,交联时间为40min。采用红外光谱对交联酶晶体与游离酶的结构进行了鉴定,结果发现酶的结构发生了变化即由α-螺旋结构转变为β-折叠,并且发生了无规则的卷曲,故可以说明游离酶在以上的结晶条件下生成性状良好的晶体。并且对交联酶晶体的基本酶学性质进行了研究,并与游离酶做了比较。通过将游离酶制成交联酶晶体之后,其在热稳定性及pH稳定性上都有显著提高,并且在水溶性有机溶剂中如50%的四氢呋喃溶液中仍能保持一定的活性,主要原因是物质的晶体状态和酶分子的化学交联的结果。最后选择紫外光引发聚丙烯微孔膜固定化方法对该转谷氨酰胺酶晶体进行膜固定化,通过对聚合条件和固定化后酶晶体的活力、最适温度、最适pH值、热稳定性、pH稳定性以及贮存期和操作稳定性的研究,得到一种理想的酶晶体膜固定化方法,制得固定化酶晶体膜。结果表明：采用紫外光引发接枝反应固定酶晶体,第一步光照反应12min,光照距离为10cm,单体浓度为20%,第二步光照时间20min,接枝率最高可达34.56%；己二胺浓度为20%,胺烷基化时间90min,胺烷基化温度50℃；戊二醛浓度2%,戊二醛作用时间40min；酶液浓度15mg/mL,固定化时间24h,固定化温度4℃在以上条件下得到的固定化酶晶体膜的活力可以保持在31.2 U/g。并对固定化酶晶体膜的酶学性质做了初步的研究,结果显示：它的最适温度是50℃,热稳定性良好,在50℃保存2.5h,酶活保留率为80%左右,经测定该酶膜在50℃的半衰期为6.5h；最适pH值6.0,在pH4.0～8.0范围内较稳定；经过对其酶活30d连续测定,发现剩余酶活约为70%。在40℃和50℃下连续反应10h后,固定化酶晶体膜的酶活保留率分别在60%和35%左右,且外观仍然都很平整,无损伤,无破裂,操作稳定性良好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 转谷氨酰胺酶的研究现状
• 1.2.1 转谷氨酰胺酶的简介
• 1.2.2 转谷氨酰胺酶催化机理
• 1.2.3 转谷氨酰胺酶的酶学性质
• 1.2.4 转谷氨酰胺酶的应用
• 1.3 交联蛋白结晶技术
• 1.3.1 交联蛋白结晶技术简介
• 1.3.2 交联蛋白晶体的制备
• 1.3.3 交联蛋白晶体的特性
• 1.4 固定化酶研究进展简介
• 1.4.1 传统固定方法
• 1.4.2 酶的膜固定化方法
• 1.5 本文研究的目的与意义
• 1.6 课题的来源及主要研究内容
• 1.6.1 课题来源
• 1.6.2 主要研究内容
• 2 转谷氨酰胺酶的分离纯化及部分酶学性质
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 转谷氨酰胺酶酶活的测定原理及方法
• 2.3.2 蛋白含量的测定
• 2.3.3 乙醇沉淀
• 2.3.4 硫酸铵饱和度的选择
• 2.3.5 超滤
• 2.3.6 Sephadex G-100柱层析
• 2.3.7 转谷氨酰胺酶纯度的测定
• 2.3.8 纯化酶的部分酶学性质研究
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 L-谷氨酸γ-单羟肟酸标准曲线及其方程
• 2.4.2 硫酸铵盐析
• 2.4.3 超滤
• 2.4.4 Sephadex G-100柱层析
• 2.4.5 纯度鉴定及分子量测定
• 2.4.6 纯酶的酶学性质
• 2.5 本章小结
• 3 交联酶晶体及其稳定性的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 酶晶体活力的测定
• 3.3.2 酶蛋白含量的测定
• 3.3.3 酶结晶量的测定方法
• 3.3.4 转谷氨酰胺酶微晶体的制备
• 3.3.5 转谷氨酰胺酶微晶体的交联
• 3.3.6 转谷氨酰胺酶微晶体的收集
• 3.3.7 交联酶晶体结构特征检测
• 3.3.8 交联酶晶体酶学性质的研究
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 转谷氨酰胺酶结晶条件的确定
• 3.4.2 转谷氨酰胺酶晶体交联条件的确定
• 3.4.3 交联酶晶体的结构特征检测
• 3.4.4 交联酶晶体酶学性质研究
• 3.5 本章小结
• 4 转谷氨酰胺酶晶体的膜固定化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 仪器与设备
• 4.2.3 固定化方法研究
• 4.2.4 固定化转谷氨酰胺酶晶体的酶学性质
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 紫外光引发接枝反应条件对接枝率的影响
• 4.3.2 间隔臂的引入
• 4.3.3 戊二醛的活化
• 4.3.4 酶晶体的固定化
• 4.3.5 BSA标准曲线绘制
• 4.3.6 固定化条件对酶活性的影响
• 4.3.7 固定化酶晶体膜表面化学结构的表征
• 4.3.8 固定化酶晶体膜的酶学性质的研究
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢