从母系遗传和表观遗传学来研究肾阴虚型慢性再生障碍性贫血的发病机制

论文摘要

目的：研究肾阴虚型慢性再生障碍性贫血（CAA）患者线粒体突变情况和骨髓中ID4基因启动子区甲基化状态,探讨母系遗传的本质——线粒体和表观遗传学与肾阴虚型慢性再障发生、发展的关系,以期进一步研究慢性再障的发病机制。方法：收集8例诊断明确的肾阴虚型CAA患者骨髓和口腔黏膜上皮,另收集2例健康人骨髓做正常对照（仅用于ID4基因启动子区甲基化的对照）,提取DNA。应用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）检测ID4基因启动子区甲基化状态；进行线粒体DNA的全测序,在骨髓标本中与剑桥序列不一致的位点再与同一患者的口腔上皮正常组织的序列比较,若此位点的变化在口腔上皮组织中未出现,则定义为突变；若在骨髓标本和口腔上皮中均出现,则定义为多态。从中西医两种医学的母系遗传角度探讨其发病机制,并对结果进行分析。结果：（1）线粒体全测序表明许多患者的突变位点发生在与线粒体氧化呼吸链密切相关的区域,涵盖了了ND1-5、ND4L、ATP6、CYTB等多个线粒体DNA的编码基因。而很多的DNA多态性则位于D-loop区。（2）8名CAA患者均检测到了ID4基因的甲基化。结论：（1）线粒体呼吸链酶复合体表达水平的改变,可能导致线粒体呼吸链氧化磷酸化解偶联、“电子漏”产生ROS引起氧化应激和能量代谢障碍,这些变化共同参与造血干细胞衰竭的发生发展过程。因此,线粒体基因突变导致的呼吸链功能障碍可能在慢性再障的发病过程中起重要作用。（2）在所有患者骨髓细胞中均检测到了ID4基因甲基化,表观遗传学在CAA的发病机制中起到一定的作用,有助于慢性再障发病机制的进一步研究。（3）本研究从中西医的肾虚和母系遗传、表观遗传学两个方面初步探讨了慢性再障的发病机制,在国际上尚未见到类似研究,意义重大。

论文目录

• 提要
• Abstract
• 引言
• 实验研究
• 一、临床资料
• （一） 研究对象
• （二） 诊断标准
• （三） 入选标准和排除标准
• （四） 中医辨证分型标准
• （五） 骨髓活检图片
• 实验一 肾阴虚型慢性再生障碍性贫血患者线粒体DNA全测序
• 一、实验材料
• （一） 主要仪器
• （二） 主要试剂及材料
• 二、主要溶液的配制方法
• （一） DEPC水的配制
• （二） 无RNA酶水的配制
• （三） RPMI-1640培养基配制
• （四） 冻存液配制
• （五） 磷酸盐缓冲液（PBS）
• （六） 无RNA酶90%乙醇的配制
• （七） 电泳缓冲液的配制
• 三、实验方法
• （一） 骨髓DNA的提取
• （二） 口腔上皮细胞基因组DNA的提取
• （三） PCR扩增mtDNA全基因组序列
• 四、结果与分析
• （一） 结果
• （二） 分析
• （三） mtDNA突变图谱
• 五、剑桥标准序列
• 讨论一 从中医传统理论来揭示慢性再障肾阴虚型的发病机制
• 一、中医学对再障的认识
• （一） 中医病名溯源
• （二） 病因病机
• 二、肾藏精、主骨生髓
• （一） 肾藏精
• （二） 肾主骨生髓
• （三） 肾与血的关系
• （四） 精与血的关系
• 三、从对衰老的认识谈再障与"肾"这个"先天之本"的关系
• 四、肾阴虚证溯源
• 五、对"阳虚易治,阴虚难调"理论的探讨
• 六、肾阴虚与母系遗传之间的关系
• 参考文献
• 讨论二 线粒体DNA在血液病发生、诊断及治疗中的意义及结果分析
• 一、mtDNA概述
• （一） mtDNA的结构特点
• （二） 线粒体的母系遗传特性
• 二、mtDNA与血液系统疾病
• （一） mtDNA异常与白血病
• （二） mtDNA与MDS
• （三） 线粒体突变在血液系统疾病中的可能作用机制
• 三、实验结果分析
• （一） 对mtDNA突变检测结果的分析
• （二） 对mtDNA多态性检测结果的分析
• 参考文献
• 实验二 肾阴虚型慢性再生障碍性贫血患者骨髓ID4基因甲基化检测
• 一、实验材料
• （一） 主要仪器
• （二） 主要试剂及材料
• 二、主要溶液的配制方法
• （一） DEPC水的配制
• （二） 无RNA酶水的配制
• （三） RPMI-1640培养基配制
• （四） 冻存液配制
• （五） 磷酸盐缓冲液（PBS）
• （六） 无RNA酶90%乙醇的配制
• （七） 电泳缓冲液的配制
• 三、实验方法
• （一） 骨髓单个核细胞制备
• （二） 基因组DNA提取
• （三） DNA浓度和纯度的测定
• （四） 基因组DNA修饰
• （五） PCR扩增
• （六） 产物检测
• 四、结果与分析
• 讨论 ID4基因甲基化检测的意义
• 一、DNA甲基化
• （一） 什么是DNA甲基化
• （二） DNA甲基化的检测方法
• 二、ID4的相关研究
• （一） ID4基因的结构与功能
• （二） Id4与细胞分化、增殖及凋亡的关系
• （三） ID4基因甲基化与血液系统肿瘤
• （四） Id4因子与细胞凋亡
• 三、基因甲基化研究的临床应用
• （一） 甲基化检测的意义
• （二） 去甲基化制剂治疗MDS的相关进展
• 参考文献
• 结语
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 致谢
• 查新报告
• 发表论著
• 发表论文
• 详细摘要