深海洋中脊沉积物砷抗性菌的多样性分析

论文摘要

自然界中的微生物在砷的生物地球化学循环中起着重要作用。海洋砷的主要来源是岩浆活动,深海热液口活动是砷的一个重要来源。微生物通过累积、甲基化、氧化、还原等作用参与砷价态改变和元素循环,但是目前关于海洋环境的砷抗性菌知之甚少,尤其是深海环境。为了解深海环境中的微生物主要的砷抗性细菌,本论文对印度洋、大西洋中脊深海沉积物砷抗性菌的多样性进行研究。本文用含有2 mmol/L NaAsO2的PTA培养基富集来自印度洋和大西洋七个不同站点的深海沉积物样品,得到七个砷抗性菌群。我们对这些菌群的砷抗性菌进行了筛选,同时构建16SrDNA文库与DGGE相结合的方法对其中三个菌群（站点IR-TVG1、IRTVG2、IR-TVG3）的结构进行了解析;分析了不同培养时间和不同砷浓度下IR-TVG2、IR-TVG3站点的抗性菌群结构的变化。从七个砷抗性菌群中共分离到102株单菌,分属于28个属50个种,主要为变形菌纲α和γ亚群与Actinobacteria（放线菌门,高G+C革兰氏阳性菌）类群。微杆菌、食烷菌、海杆菌、Idiomarina、盐单胞菌和假交替单胞菌占优势,其中1株菌可能属于新属新种,15株菌可能属于新种。通过构建16SrDNA文库与DGGE结合的方法,确定站点IR-TVG1抗性菌群中的优势抗性菌为假交替单胞菌;站点IR-TVG2抗性菌群中的优势抗性菌为食烷菌与微杆菌;站点IR-TVG3抗性菌群中的优势抗性菌为微杆菌。从IR-TVG2、IR-TVG3分离到的微杆菌虽然16S rRNA序列完全一样,但它们的重复PCR指纹图谱和砷抗性能力不一样。为了了解取样时间和砷浓度对菌群结构的影响,我们选取IR-TVG2、IR-TVG3站点的抗性菌群做进一步的DGGE分析。结果显示,不同取样时间和不同砷浓度下两站点的抗性菌群结构变化明显。在2mM富集培养条件下,IR-TVG2在培养的初期只有一优势条带,但28h后出现另一条优势条带;但在20mM富集培养条件下没有随时间发生变化。IR-TVG3在两种浓度的富集培养条件下,菌群结构一直没有变化。在0-60mM的砷浓度下,IR-TVG2样品的优势条带随着砷浓度的提高而变少,而IR-TVG3样品,在低浓度砷富集培养条件下仅一条优势条带,但随着砷浓度的提高而出现了第2条优势条带。对筛选到的102株单菌进行了砷抗性范围测定,可在10mM NaAsO2存在下正常生长的菌株仅占总菌数的16.6%,这些高抗性的单菌主要筛选自IR-TVG2和IR-TVG3。这可能是这两站点混合菌群比其他菌群抗性高的原因。这些具有高抗性的菌株主要属于Microbacterium属,占52.6%;但实验结果表明,菌株抗性与种属没有必然联系,同属甚至同种的细菌有时表现出差异极大的抗性能力。此外不同的培养基培养条件,相同的菌株也会表现出差异的抗性能力。利用兼并引物扩增砷流出泵基因（arsB与ACR3）,共获得17个目的大小的基因片段,测序比对结果显示,这些基因与已报道的砷流出泵基因相似度在75%左右。实验结果表明,单菌是否具有砷流出泵与其种属和抗性能力没有必然联系。在获得的优势菌中,均未扩的砷流出泵基因,说明它们存在其他的砷抗性机制。对从热液口虾的头部富集分离到的单菌D8-2（Brachybacterium paraconglomeratum,100%）进行初步的研究,结果显示该菌具有良好的砷抗性能力,但不具有砷氧化能力,D8-2对砷具有很好的胞内累积作用,累积量达到2313.7μg As g-1细胞干重,为目前的细菌砷累积量之最高。对来自站点IR-TVG1的单菌CK-I1-6（Pseudomonas alcalophila,99.9%）进行初步的研究,扩增得到一750bp大小的基因片段,该基因与Pseudomonas sp. A07的砷流出泵ACR3基因相似性76%。该菌有良好砷抗性,但不具有砷氧化能力,其抗性机制可能与砷流出泵相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 砷的来源、污染现状及砷污染废水治理方法
• 1.2 砷的元素循环
• 1.3 微生物在砷循环中的作用
• 1.4 微生物对特定环境中砷的地球化学行为的影响
• 1.5 本文的研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 基本方法
• 2.3 海洋砷抗性菌的富集、分离和鉴定
• 2.4 砷抗性菌菌群结构分析
• 2.5 不同生长时期及不同砷浓度下砷抗性菌菌群结构的变化
• 2.6 砷抗性菌分离株的研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 深海砷抗性菌的富集、分离鉴定、菌群结构分析
• 3.1.1 样品中重金属含量和砷含量的测定
• 3.1.2 砷抗性菌群中可培养菌的分离及鉴定
• 3.1.3 菌群中可培养菌165 rRNA 系统进化分析
• 3.1.4 菌群结构分析
• 3.1.4.1 DGGE 与165 rDNA 文库法结合分析菌群结构
• 3.1.4.2 不同培养时间下的菌群结构变化
• 3.1.4.3 不同砷浓度下菌群结构的变化
• 3.1.5 讨论
• 3.2 砷抗性菌的研究
• 3.2.1 砷抗性菌的抗性能力初步测定
• 3.2.2 砷抗性基因的克隆
• 3.2.2.1 砷流出泵（arsB 或ACR3）基因的克隆
• 3.2.2.2 砷氧化酶（arsB 或ACR3）基因的克隆
• 3.2.3 砷抗性菌Alcanivorax和Idiomarina的石油降解能力检测讨论
• 3.2.4 砷抗性菌D8-2 的初步研究
• 3.2.4.1 D8-2 的特性
• 3.2.4.2 砷氧化能力检测
• 3.2.4.3 D8-2 对砷的吸附作用
• 3.2.5 砷抗性菌CK-11-6 的初步研究
• 3.2.5.1 菌株CK-11-6 的特性
• 3.2.5.2 CK-11-6 的生理生化特性
• 3.2.5.3 CK-11-6 砷氧化能力检测
• 3.2.5.4 ACR3 基因的扩增
• 3.2.6 讨论
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录