鸭疫里默氏杆菌转座子突变库的构建以及生物被膜形成相关基因的筛选

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）引起的鸭、鹅、火鸡及其它鸟类的一种高致病性、接触性传染病,给养鸭业造成巨大的经济损失,是目前危害养鸭业最为严重的传染病之一。目前RA基因组序列已在Genbank中公布,预测编码基因超过2000个,但目前已知功能基因只有少数。大规模突变库构建成为高通量研究RA基因功能的主要工具。本研究主要通过转座子随机插入突变的方法,构建RA突变库,然后从基因水平上鉴定与鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成有关的基因。主要内容为通过结合转导的方法将含转座子质粒Tn-X的大肠杆菌BW19851与本实验室分离保存的RA CH3进行接合转导,使转座子Tn-X随机插入CH3基因组,以Tn-X上的红霉素抗性进行阳性结合子的筛选,构建了一个包含2000株细菌的随机突变株文库,并最终计算转导效率约为4×10-6。对突变株文库进行生物被膜减少株的筛选,共获得了生物被膜典型减少株38株,其生物被膜的减少率呈现在40%-100%范围内,推测这些被阻断的基因可能在生物被膜形成过程的不同时期参与作用,从而使相应突变株的生物被膜减少率呈现在不同范围内。其中生物被膜减少率达99%以上的突变株有五株。通过Genome walking等技术进行插入位点的序列测定,最终成功鉴定出相关的插入位点。在所有鉴定出的插入位点中有四个基因至少重复出现2次,推测这几个基因对生物被膜的形成起着重要的作用。Southern blot检测转座子Tn-X在基因组的插入次数,显示其只插入一次。针对相关基因的功能鉴定、基因互补试验等相关研究正在进行中。总的来说,本研究首次构建了鸭疫里默氏杆菌的转座子随机突变库,并成功鉴定出参与生物被膜形成的基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 1. 鸭疫里默氏杆菌的研究进展
• 1.1 分类地位
• 1.2 生物学特性
• 1.3 血清型
• 1.4 毒力基因与致病因子
• 2. 病原细菌毒力基因鉴定方法的研究进展
• 2.1 生物化学方法
• 2.2 遗传学方法
• 2.3 抑制性差减杂交技术（suppression subtractive hybrization,SSH）
• 2.4 选择性捕获转录序列（selective capture of transcribed sequences,SCOTS）
• 2.5 体内诱导抗原（in vivo induced antigen technology,IVIAT）
• 展望
• 主要参考文献
• 第二部分 实验内容
• 第一章 鸭疫里默氏杆菌转座子突变库的构建
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 抗生素及使用浓度
• 1.4 试剂与器材
• 1.5 PCR引物
• 2 试验方法
• 2.1 鸭疫里默氏杆菌CH3和大肠杆菌BW19851的复苏与培养
• 2.2 鸭疫里默氏杆菌CH3的药敏试验
• 2.3 结合转导
• 2.4 突变体的鉴定
• +Kan⁺双抗初筛选'>2.4.1 Erm⁺Kan⁺双抗初筛选
• 2.4.2 双重PCR的确定
• 2.5 突变体库的保存
• 3 结果和分析
• 3.1 鸭疫里默氏杆菌CH3的药敏试验结果
• 3.2 结合转导前供受体菌的培养
• 3.3 结合转导及突变体的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 作为受体菌鸭疫里默氏杆菌菌种的选择
• 4.2 结合转导前细菌的培养方式及生长状态
• 2+、温度、时间对结合转导的影响'>4.3 Mg²⁺、温度、时间对结合转导的影响
• 4.4 供受体菌菌数及比例
• 4.5 用于筛选突变株的抗生素的选择
• 主要参考文献
• 第二章 生物被膜形成相关基因的筛选及分析
• 1 实验材料
• 1.1 筛选对象
• 1.2 试剂与器材
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 器材
• 1.3 PCR引物
• 2 实验方法
• 2.1 生物被膜减少株的筛选
• 2.2 生物被膜减少株插入序列的鉴定
• 2.3 Southern blot分析Tn-X的插入
• 2.4 五株突变株的形态特性观察及生长曲线测定
• 3 实验结果
• 3.1 筛选突变株生物被膜减少株的鉴定结果
• 3.2 生物被膜减少株插入序列的鉴定结果
• 3.3 Southern blot分析Tn-X的插入结果
• 3.4 五株突变株的形态特性观察及生长曲线测定结果
• 4 讨论
• 主要参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 附录：攻读硕士学位期间发表的论文