论文摘要
人核糖核酸酶抑制因子（Human Ribonuclease Inhibitor, hRI）是广泛存在于哺乳动物细胞浆中的一种酸性蛋白,分子量约为50 kDa。其基因位于染色体11p15.5,三级结构呈对称的马蹄型。hRI是核糖核酸酶A（Ribonuclease A, RNase A）的抑制剂（Ki=4.0×10-14M）,可以有效抑制其对RNA的水解。血管生成因子（Angiogenin,Ang）属RNase A超家族成员,根据cDNA序列分析,Ang与RNase A有35%的同源性。hRI能与Ang以1:1的化学剂量紧密结合（Ki=7.1×10-16M）。Ang在体内、外均具有较强的诱发血管生成的活性,hRI可以与Ang形成紧密的非共价结合,从而抑制其促血管生成的活性。在鸡胚绒毛膜尿囊（CAM）实验中,Ang可以强烈刺激新生血管形成,外源给予hRI能抑制Ang的促血管形成活性。新生血管性青光眼（NVG）是继发于视网膜静脉阻塞、糖尿病性视网膜缺血性疾病或炎症之后的难治性青光眼。视网膜缺血引起虹膜表面和前房角新生血管和结缔组织膜的形成,周边虹膜与小梁网紧密粘连,前房角受阻,眼压升高,从而引起青光眼的相关症状。新生血管性青光眼主要治疗手段是通过手术解除阻塞,并配以药物抑制术后血管及组织增生,防止再粘连。hRI具有抑制Ang和碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）促血管增生的作用,因此hRI可能成为一种有效的抗血管增生药物而用于新生血管性青光眼的临床治疗。为此我们对正常的新西兰大白兔行模拟治疗新生血管性青光眼的小梁网切除术,术中和术后给予hRI,观察其抑制术后血管和组织增生情况。此外,hRI含有32个高度保守的半胱氨酸残基,其中至少30个以还原型形式存在,还原型巯基是保持hRI正常生物学活性所必需的。丰富的半胱氨酸残基可能赋予hRI抗氧化的潜力。本实验室在hRI的抗氧化能力方面已进行了部分体、外实验,证明hRI过表达的大鼠神经胶质瘤C6细胞在过氧化氢（H2O2）损伤时,表现为较低的乳酸脱氢酶（LDH）漏出量、较少的丙二醛（MDA）产生量[12]。hRI对CCl4诱发小鼠肝脏损伤模型也具有保护作用,可以提高超氧化物歧化酶（SOD）活性,同样能有效减少MDA产生量,减轻肝细胞损伤。糖尿病性白内障发病过程中由于单糖氧化产生大量氧自由基,损伤晶状体蛋白和晶状体上皮细胞膜,导致晶状体蛋白变性和细胞通透性改变,从而引起白内障的发生发展。由于hRI可能具有较强的抗氧化能力,所以我们将hRI用于Wistar大鼠糖尿病性白内障模型,观察其对糖尿病性白内障的防治作用。为了节约成本、提高产量、方便纯化及增加hRI可溶性表达,本实验室构建了pGEX-6p-1-hri融合表达质粒,将hRI的基因与谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase, GST）基因融合表达。收集大量培养的菌体,超声破碎,离心后收集上清,通过Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱分离纯化GST-hRI融合蛋白。以Prescission蛋白酶切除GST标签并回收hRI,比较GST-hRI与hRI活性差别。然后将上述纯化融合蛋白GST-hRI用于动物实验。上述研实验结果表明,GST-hRI抑制RNase A的活性优于hRI。GST-hRI在体内具有较强的抗氧化作用和抗血管生成作用。对糖尿病性白内障的发展有一定的延缓作用;一定程度上抑制小梁网切除术后新生血管的形成。
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