甘油培养基中有机氮源对大肠杆菌生长和外源蛋白表达影响的研究

论文摘要

本文研究了甘油培养基中有机氮源与溶氧水平对大肠杆菌表达外源蛋白（嘌呤核苷磷酸化酶）的影响,有机氮源对以甘油为碳源大肠杆菌菌体生长的影响及其机理的研究。在5 L发酵罐水平,培养基组分中的蛋白胨对大肠杆菌外源蛋白表达有十分重要的作用,在选取的五种蛋白胨中,蛋白胨Ⅰ最有利于大肠杆菌表达外源蛋白嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）,与其它四种相比,无论是蛋白含量还是酶活均为最高,外源蛋白占总蛋白的含量、外源蛋白酶酶活和外源蛋白比酶活分别达到41.9%,440 U和3.8 U/mg。同时,控制适当水平的溶氧（10-30%）,有助于外源蛋白的表达,外源蛋白占总蛋白的含量、外源蛋白酶酶活和外源蛋白比酶活均为最高,10-30%的溶氧水平既满足菌体正常生长对氧气的需求,又避免游离氧对已表达出的外源蛋白产生结构性破坏,能够较好地保护外源蛋白的活性。此外在甘油培养基中有机氮源也对大肠杆菌菌体的生长有影响,在摇瓶培养水平,甘油基本培养基中添加一定量的氨基酸能促进大肠杆菌生长,在选取的12种氨基酸中,添加Ser和Arg促进生长效果最好,5.5 h时在基本培养基中添加0.35 mMSer和Arg,菌体浓度分别增加了63%和53%。实验证明,氨基酸对大肠杆菌生长的促进作用并不是以碳源或氮源形式起作用的,而是通过加快甘油比消耗速率实现的,并且这种促进生长作用可能只存在于非磷酸烯醇式丙酮酸碳水化合物磷酸转移酶系统（non-PTS）的糖类。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 嘌呤核苷磷酸化酶
• 1.1.1 嘌呤核苷磷酸化酶研究背景
• 1.1.2 PNPase结构
• 1.1.3 PNPase催化机制
• 1.1.4 PNPase医药价值与用途
• 1.2 外源蛋白表达
• 1.2.1 分子水平
• 1.2.2 发酵条件
• 1.3 氨基酸代谢
• 1.3.1 氨基酸作用
• 1.3.2 氨基酸代谢
• 1.4 PTS系统与非PTS系统
• 1.4.1 PTS系统
• 1.4.2 非PTS系统
• 1.5 甘油代谢及其调节
• 1.5.1 甘油简介
• 1.5.2 甘油代谢
• 1.5.3 甘油代谢调节
• 1.6 本文研究内容及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 菌株保藏
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养方法
• 2.1.5 实验试剂与仪器
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 菌体浓度
• 2.2.2 高碘酸法测甘油含量
• 2.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳-目的蛋白含量的测定
• 2.2.4 嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）酶活的测定
• 2.2.5 葡萄糖的测定
• 第3章 蛋白胨与溶氧对大肠杆菌表达外源蛋白PNPase的影响
• 3.1 蛋白胨对大肠杆菌表达外源蛋白PNPase的影响
• 3.1.1 蛋白胨对PNPase表达量的影响
• 3.1.2 蛋白胨对PNPase酶活的影响
• 3.1.3 蛋白胨对PNPase比酶活的影响
• 3.2 溶氧对大肠杆菌表达外源蛋白PNPase的影响
• 3.2.1 溶氧对PNPase蛋白表达量的影响
• 3.2.2 溶氧对PNPase酶活的影响
• 3.2.3 溶氧对PNPase比酶活的影响
• 3.3 本章小结
• 第4章 甘油培养基中有机氮源对大肠杆菌生长影响的深入分析
• 4.1 甘油培养基中有机氮源对大肠杆菌生长影响研究
• 4.1.1 有机氮源对大肠杆菌生长影响
• 4.1.2 有机氮源对发酵液残留甘油浓度的影响
• 4.1.3 有机氮源对大肠杆菌关于氮源得率系数影响
• 4.1.4 有机氮源对发酵过程总碱耗的影响
• 4.1.5 不同有机氮源组合对大肠杆菌生长影响的影响
• 4.2 葡萄糖培养基中有机氮源对大肠杆菌生长影响研究
• 4.3 本章小结
• 第5章 氨基酸对大肠杆菌利用甘油生长的加速作用
• 5.1 甘油基本培养基与完全培养基中大肠杆菌生长情况
• 5.2 氨基酸对大肠杆菌生长的促进作用
• 5.3 氨基酸对大肠杆菌促进生长作用的机理研究
• 5.3.1 氨基酸的促进生长作用不是作为碳氮起作用
• 5.3.2 氨基酸促进甘油比消耗速率
• 5.3.3 氨基酸促进生长作用只存在于非PTS糖
• 5.4 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录