固定化乳酸菌发酵产L-乳酸的研究与应用

论文摘要

本文以干酪乳杆菌lactobacillus casei为研究对象,首先对L-乳酸的定量方法进行了研究,建立了毛细管电泳法测定发酵液中L-乳酸的最佳条件。以干酪乳杆菌的原生质体为材料,采用紫外和激光双因子诱变剂,结合代谢调控手段对lactobacillus casei进行诱变选育,对诱变后的突变株ZZ-06进行生理生化特性考察、关键酶酶活测定及遗传稳定性研究。采用响应面法对ZZ-06发酵培养基和培养条件进行优化。对ZZ-06细胞进行包埋法固定,并优化其固定化条件。利用扫描电镜对制备的ZZ-06固定化细胞胶珠小球进行微观层次上观察,以验证包埋效果,并将其投入到L-乳酸发酵生产实验中,考察其产酸性能。最终,将固定化ZZ-06细胞投入到酱油发酵实验中,考察其在酱油中产酸性能,以期望日后能够用于实际酱油生产。采用毛细管电泳法对L-乳酸进行测定,对毛细管电泳操作条件和缓冲液体系进行优化。当分离电压为-21KV,温度为20℃,检测波长为254 nm,采用pH值为7.5的5mmol/L邻苯二甲酸氢钾与0.6mmol/L CTAB混合溶液作为缓冲液体系运行,L-乳酸的分离效果最好；线性方程为Y=02389X+2.778；在50～1000μg·mL-1浓度范围内,R2=0.9996,表明该方程呈现良好的线性关系,样品平均加标回收率高于99.7%。运用紫外和激光复合诱变干酪乳杆菌原生质体并结合代谢调控手段进行高产菌株选育,得到一株高产菌株ZZ-06。采用响应面法对ZZ-06进行发酵条件和培养基优化,得到最优条件为：葡萄糖110g/L,MnSO4·4H2O 0.279831g/L、酵母膏17.9882g/L、麦芽汁33.9029 ml/L,MgSO4·7H2O 0.6g/L, CaCO3 50g/L,菌龄14h,接种量8%；ZZ-06的最适生长温度和发酵温度分别为38℃和43℃。选择出最适合用于固定化乳杆菌ZZ-06的包埋材料为海藻酸钠。采用响应面法对固定化条件进行优化,最优制备条件为：海藻酸钠3.44g/L、氯化钙1.45g/L、交联时间13.9h,理论预测L-乳酸产量为107.84g/L。对该模型进行6次验证性实验与理论预测值相差不大,表明该模型可以较好地预测实际ZZ-06固定化效果。用扫描电镜对最优固定化条件制备的胶珠小球进行观察,从微观层次上验证固定化干酪乳杆菌ZZ-06效果显著。同时对最优固定化条件制备的胶珠小球进行发酵稳定性实验,连续生产多次,产物无明显减少。将固定化乳酸菌添加到酱油发酵实验中,固定化乳酸菌能够在未经巴士灭菌的酱油原油中产酸,在较低温度下也能够发酵产L-乳酸,选择10%的接种量较为合适,对于以后酱油实际生产具有较好的指导意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 乳酸的研究概况
• 1.2.1 乳酸的结构与性质
• 1.2.2 乳酸的生产方法
• 1.2.3 国内外对乳酸及衍生产品的研究进展
• 1.3 乳酸的应用进展
• 1.4 固定化细胞发酵产乳酸的研究进展
• 1.5 本论文研究意义及主要内容
• 第2章 毛细管电泳法测定L-乳酸方法的研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 标准品溶液和缓冲液的制备
• 2.2.2 样品溶液的制备
• 2.2.3 标准曲线的制作
• 2.2.4 电泳操作条件
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 毛细管电泳条件的优化
• 2.3.2 标准曲线的制作
• 2.3.3 加标回收率试验
• 2.3.4 精密度试验
• 2.3.5 发酵液中L-乳酸的测定
• 2.4 小结
• 第3章 高产L-乳酸菌株的原生质体代谢调控复合诱变选育
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 菌种
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌体的培养
• 3.2.2 原生质体的制备
• 3.2.3 原生质体形成率和再生率计算
• 3.2.4 原生质体复合诱变
• 3.2.5 致死率的计算和正突变菌株的筛选
• 3.2.6 遗传稳定性实验
• 3.2.7 关键酶酶活的测定
• 3.2.8 L-乳酸含量的测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 原生质体的制备与再生结果
• 3.3.2 原生质体的复合诱变结果
• 3.3.3 高产菌株的筛选
• 3.3.4 遗传稳定性实验
• 3.3.5 突变菌株生理生化实验和显微观察
• 3.3.6 关键酶酶活测定结果
• 3.4 小结
• 第4章 响应面法对干酪乳杆菌ZZ-06产L-乳酸培养基和发酵条件的优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要仪器设备
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 菌种
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养方法
• 4.2.2 L-乳酸含量的测定方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 最适碳源的选择
• 4.3.2 最适氮源的选择
• 4.3.3 最适菌种年龄的选择
• 4.3.4 最适接种量的选择
• 4.3.5 温度的影响
• 4.3.6 无机盐的影响
• 4.3.7 Plackett-Burman主要影响因子确定实验
• 4.3.8 主要影响因子最陡爬坡实验
• 4.3.9 响应面实验
• 4.3.10 验证性实验
• 4.4 小结
• 第5章 固定化干酪乳酸菌ZZ-06发酵产L-乳酸的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要仪器设备
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 菌种
• 5.1.4 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 培养方法
• 5.2.2 微生物细胞固定化方法
• 5.2.3 L-乳酸含量的测定方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 最适包埋法的选择
• 5.3.2 响应面法对干酪乳杆菌ZZ-06固定化条件的优化
• 5.3.3 响应面实验
• 5.3.4 胶珠小球的扫描电镜观察
• 5.3.5 胶珠小球发酵稳定性的研究
• 5.4 小结
• 第6章 固定化乳酸菌在酱油生产中的应用研究
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 主要仪器设备
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 菌种
• 6.1.4 培养基
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 培养方法
• 6.2.2 酱油参数检测
• 6.2.3 菌株耐盐度实验
• 6.2.4 多因素对固定化乳酸菌在酱油中产酸的影响
• 6.2.5 L-乳酸含量的测定方法
• 6.3 结果与讨论
• 第7章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表论文
• 致谢