论文摘要
[目的]本论文以I/R脊髓损伤与能量代谢关联性为首发研究背景,应用定量蛋白质组及血清代谢组学方法,观察I/R脊髓损伤与能量代谢相关蛋白与酶的变化特点,旨在组学水平动态研究I/R兔脊髓损伤病理过程中的蛋白质组与代谢图谱变化特征,试图阐述急性I/R脊髓损伤所导致延迟性神经功能障碍与能量代谢障碍具有相关性,为发现其损伤新机制和新药物靶标提供重要依据。[方法]建立实验性I/R兔脊髓损伤模型,病理形态学观察与行为学观察。采用随机抽样法分为3组（n=6）：假手术组（SHAM）、单纯缺血30min组（I30mmin）、缺血30mmin再灌注24h组（I30minR24h）,进行运动功能评分（改良Tarlov评分法）和病理形态学观察。双向凝胶电泳（2D-DIGE）定量分析；首先采用CyDye荧光标记双向电泳分离蛋白，扫描荧光图像,DeCyder分析软件图像分析.获得差异蛋白信息。提取实验兔血清,通过气相色谱-飞行时间质谱仪（GC-TOF-MS）, Masslynx4.0数据处理系统;Nist 02数据库分析小分子产物名称及变化波峰值,所有兔GC/TOF-MS数据经成分分析获得相应负载图和得分图；通过空间二维图观察3组代谢小分子产物连续变化模式。[结果]成功建立模型兔18只。与SHAM组比较：兔I30min组与I30minR24h,组后肢评分分别为2.6分与4.6分。病理形态学显示缺血再灌注后细胞核肿胀,核膜明显,胞核着色较淡,多位于细胞中央,神经元细胞外形随着再灌注时间由初始延长逐渐变形,突起减少,直至细胞核移位深染,出现核碎裂现象。并随其时间延长,可见神经元细胞局部核大,核内异染色质略增多,胞质内脂褐素增加,可见粗面内质网,线粒体,周围有髓神经纤维髓鞘板层轻度分离,核基质、胞质基质轻度空化,细胞器减少。神经毡突起肿胀空化,神经丝减少,线粒体致密,神经纤维髓鞘变薄等。荧光标记双向电泳图像分析,以两倍差异为阈值共送检差异蛋白点49个进行筛查差异表达蛋白。其中质谱（MALDI-TOF/TOF MS）技术成功鉴定出其中21个差异蛋白。其结果：2个蛋白在脊髓I/R组织中特异上调表达（神经纤维蛋白M,微管蛋白）,19个蛋白在脊髓I/R中下调表：其中与能量代谢相关蛋白5种.这些蛋白三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogennse;GAPDH）、烯醇酶（Beta-enolase;ENO3）、琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase;SDHA）、糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase;PYGM）及丙酮酸激酶（Pyruvate kinase;PKM2）在I/R脊髓组织中明显下调（P<0.05）。代谢GC/TOF-MS分析共鉴定出小分子物质51个（其中1个为内标物）；代谢产物主要分为4类：氨基酸,糖类,脂类及其它。结果显示：得分图显示各组之间存在明显类别差异。实验结果显示小分子物质代谢变化24h点达到最高峰,以后趋于回归正常代谢变化。[结论]1研究结果证实了脊髓存在再灌注损伤。表明缺血缺氧本身对脊髓有损伤,而再灌注改善血循环下其病理改变并未因此减轻而是加重,证明I/R后脊髓发生了二次损伤。研究结果表明随着I/R时间的延长和病理改变严重而发生重要的蛋白质组与代谢组学变化；发现I/R后24h是小分子代谢产物最活跃时间阶段和关键时间点。因此提出I/R兔脊髓损伤病理严重程度与组学变化具有时间依从性,即蛋白质组与代谢组学变化也是随着I/R时间的延长而发生重要的组学变化,具有重要时间上的应答关系。提出在缺血再灌注损伤24h是蛋白质组和代谢组学特异变化的重要时间窗。提示在此阶段可能是脊髓再灌注损伤可逆性调节的最关键时间区域。2筛查与鉴定出5种参与其能量代谢相关的关键酶和调节酶（GAPDH、ENO3、SDHA、PYGM及PKM2）在脊髓I/R发生发展过程中起到重要调节作用,可能是其重要的病理基础。并发现这5种酶在脊髓I/R损伤过程中发生显著一致性下调变化趋势；尤其三磷酸甘油醛脱氢酶和琥珀酸脱氢酶作为参与糖酵解和三羧酸循环中的关键酶受到抑制出现下调表达；说明脊髓I/R后发生了细胞能量代谢和糖代谢障碍,并贯穿着早期脊髓缺血性损伤与再灌注性损伤全过程,提出这5个酶的代谢调节变化可能在脊髓损伤与修复机制中具有重要作用。3急性I/R脊髓损伤代谢模式由最初无氧代谢为主要代谢方向,随着再灌注时间延长向有氧代谢方向转运。提出急性I/R损伤初始过程中脊髓内发生严重的能量代谢障碍,尤其是糖代谢障碍。本论文的贡献与创新点：1.创新性将蛋白质组与代谢组学技术相结合,对急性I/R脊髓损伤与修复病理全过程进行了高通量的筛选分析及相互验证,尤其是两种高通量实验技术整合,为我们提供了一个崭新的思路和技术平台,使我们最终得到大量的实验数据。目前尚没有任何有关两组学技术结合进行I/R脊髓损伤机制相关研究报道。2.率先提出I/R兔脊髓损伤病理严重程度与组学变化具有时间依从性。即蛋白质组与代谢组学变化也是随着I/R时间的延长而发生重要的组学变化。提出在缺血再灌注损伤24h是蛋白质组和代谢组学特异变化的重要时间窗。提示在此阶段可能是脊髓再灌注损伤可逆性调节的最关键时间区域。3.鉴定与筛查出参与其能量代谢相关的关键酶（GAPDH、ENO3、SDHA、PYGM及PKM2）在I/R发生发展过程中起到重要调节作用,提出可能是脊髓I/R过程中的重要病理基础。提出急性I/R脊髓损伤代谢模式由最初无氧代谢为主要途径,并随着再灌注时间延长向有氧代谢方向转运。认为急性I/R脊髓损伤初始过程脊髓内发生严重的能量代谢障碍,尤其是糖代谢障碍。本研究成果将为I/R脊髓损伤新机制研究提供了新证据。
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