论文摘要
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起的慢性感染性疾病,同时也是一种免疫紊乱性疾病。目前的研究提示结核性肉芽肿在TB的发生、发展和转归过程中扮演了双重角色。作为TB免疫的起始细胞和主要效应细胞,巨噬细胞始终参与了Mtb感染及肉芽肿形成、发展和转归的全过程。巨噬细胞是一种高度可塑的复杂群体,在不同的微环境下,巨噬细胞可发生表型和功能极化从而呈现出不同的功能。为了进一步探讨不同类型巨噬细胞在Mtb感染过程中的作用,阐明结核性肉芽肿形成和发展过程中巨噬细胞的极化状态及其可能的调控机制,本研究进行了以下四部分的探讨：1不同极化状态巨噬细胞的诱导、表型鉴定及其对Mtb的杀伤作用我们首先以人单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）作为研究对象,采用IFN-γ+LPS作为M1型巨噬细胞的诱导剂,IL-4作为M2型巨噬细胞的诱导剂,在体外对MDM进行了极化诱导,并对诱导后M1和M2型巨噬细胞的分子表型及细胞因子分泌情况进行了鉴定。以未处理的MDM作为对照,我们对体外诱导的不同类型的巨噬细胞用Real-Time PCR检测了CXCL10、CXCL11、CCR7,CCL17和CCLl8基因的表达；用流式细胞术检测了巨噬细胞上HLA-DR、CD86,CD163（清道夫受体）和CD206（甘露糖受体）的表达；用ELISA检测了细胞培养上清中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ和CCL18的含量。综合分析巨噬细胞的表面活性标志的表达特征和细胞因子检测结果,表明我们在体外成功地用IFN-γ+LPS诱导了M1型巨噬细胞,用IL-4诱导了M2型巨噬细胞。在此基础上,我们进一步比较了Mtb感染对巨噬细胞极化表型的影响,以及不同极化状态的巨噬细胞对Mtb的杀伤作用。研究发现Mtb感染后可以诱导巨噬细胞形成M1/M2混合表型；与未处理对照比较,M1型巨噬细胞对Mtb的杀伤功能显著增强,而M2型巨噬细胞的杀菌功能则受到明显抑制。本部分研究首次揭示了Mtb感染后巨噬细胞的活化类型及不同类型巨噬细胞在Mtb感染过程中的作用。2人结核性肉芽肿巨噬细胞的表型鉴定在本研究中,我们采用免疫组化染色对人肺结核性肉芽肿组织进行检测,发现有大量的活化巨噬细胞浸润,M1型巨噬细胞的活化标志诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和M2型巨噬细胞的表面标志物CD206在肉芽肿巨噬细胞均有表达。Real-Time PCR检测显示,与对照组织相比,M1型巨噬细胞相关基因CXCL10和CXCL11,M2型巨噬细胞相关基因CCL17和CCL18在结核性肉芽肿组织中均表达上调。本部分的研究结果提示人肺结核性肉芽肿中有M1/M2混合型巨噬细胞浸润,这些极化的巨噬细胞在Mtb感染过程中扮演重要角色。3结核性肉芽肿形成和发展不同阶段的巨噬细胞极化表型和功能改变研究在本研究中,我们通过Mtb感染人外周血单个核细胞（PBMC）,成功构建人结核性肉芽肿体外模型,发现在肉芽肿内有大量活化的巨噬细胞聚集。硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验检测结果显示,Mtb感染可以增强肉芽肿巨噬细胞呼吸爆发功能,诱导肉芽肿巨噬细胞活化。通过对巨噬细胞极化标志物及培养上清液细胞因子水平检测发现,在Mtb感染早期肉芽肿巨噬细胞活化为具有杀菌功能的M1型巨噬细胞,随着感染时间的延长,巨噬细胞逐渐向M2型改变。这些研究结果揭示了结核性肉芽肿形成和发展过程中巨噬细胞的活化类型及功能变化。4巨噬细胞的极化类型及氧化还原状态对肉芽肿形成和发展的影响及意义在本研究中,我们在结核性肉芽肿体外模型构建前,分别将巨噬细胞诱导分化为M1和M2型。研究发现,诱导的M1型巨噬细胞有利于肉芽肿组织对结核菌的杀伤,促进肉芽肿的形成。油红O染色发现,在Mtb感染过程中肉芽肿巨噬细胞发生泡沫化改变,M2型巨噬细胞可显著促进泡沫巨噬细胞的形成,从而导致Mtb在细胞内潜伏感染。此外,我们还发现Mtb感染后肉芽肿巨噬细胞还原型谷胱甘肽（GSH）水平逐渐降低,促进肉芽肿呈氧化应激状态。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以显著纠正细胞内的氧化应激,增强巨噬细胞对Mtb的杀菌活性,有利于控制结核菌感染。研究结果提供了一种未来TB临床治疗的可能性方案,即通过诱导M1型巨噬细胞从而控制Mtb潜伏感染的新治疗策略,为结核肉芽肿组织因氧化应激诱导的巨噬细胞杀菌活性减低提供新的靶点和研究思路。