博莱霉素大鼠肺微血管内皮细胞表型与肺纤维化相关性研究

论文摘要

目的:血管内皮细胞（endothelial cell, EC）作为血管壁基本的结构和功能单位,是血管屏障重要的组成部分,生理状态下在调节血管内外物质交换、维持内环境的稳定中起着关键作用。在损伤因子的作用下,通过一系列调控机制,EC即可发生应激反应以消除致病因子对机体的损伤作用,与此同时,EC通过表型转变参与损伤组织的修复,如炎症所致的基底膜损伤或断裂的重建。一旦其调节机制发生异常,则导致形态和功能的改变,并可能成为各种疾病发生的主要启动因素之一。肺急性损伤的发病过程包括急性肺泡炎期和损伤组织修复重塑阶段,而血管反应是炎症发生的中心环节,其中EC紧密连接开放、血管通透性增高是炎症反应的主要表现形式,它不仅为清除损伤因子及坏死组织提供了必要的物质基础,而且为损伤组织的重建提供了保证。随着组织修复的完成,肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs）的功能恢复正常。但是我们前期研究显示,博莱霉素（bleomycin, BLM）损伤大鼠PMVECs间紧密连接（tight junction, TJ）却持续开放,即使肺间质基质已过度沉积,PMVECs的TJ仍未能恢复正常。这种内皮屏障功能的异常为纤维化发生时单核细胞游出并释放各种致纤维化生长因子提供了途径。在PF发生过程中,成纤维细胞（fibroblast, Fb）转化为肌成纤维细胞（myofibroblast, MFb）是关键的细胞事件之一。在Fb转化的过程中,细胞因子及其形成的网络起着重要的作用。我们的前期研究表明,不同致病因子均可引起几乎相同的细胞因子的表达上调,而且在致纤维化过程中起着重要作用的细胞因子,如TGF-β1、CTGF、IGF等在正常生理代谢中亦有表达,提示相关的细胞因子不仅在致纤维化中有异常表达,而且是细胞正常生理代谢中不可或缺的调控因素。已经证实,细胞因子的表达与细胞的功能密切相关,如作为血细胞主要成分之一的单核细胞并不具备分泌细胞因子的功能,但当其游走至组织间或肺泡时则转变为具有强大分泌功能的巨噬细胞。单核细胞表型的转变在抗组织损伤中起着重要作用。EC是分泌CTGF的细胞之一,它具有促进Fb转化为MFb的作用。在损伤因子作用下,EC间TJ开放意味着其形态和功能已发生明确改变,但是BLM损伤大鼠肺EC间的TJ持续开放似提示PMVECs表型转变的调控机制发生紊乱。在此基础上,表型发生改变的PMVECs分泌CTGF的功能是否发生异常,并成为PF形成的主要诱发因素之一,目前未见报告。本实验通过光镜、电镜、ELISA检测法及免疫组织化学染色等方法,观察肺炎及PF大鼠肺组织的病理过程及PMVECs形态学改变,比较两组血清CTGF的含量及时相变化趋势和两组大鼠肺组织MVECs的CTGF表达情况,分析BLM损伤大鼠PMVECs形态、功能的改变与CTGF表达的关系,以探讨PMVECs表型与PF发生的关系。方法:SD大鼠45只,体重150±20 g,雌雄不拘（第四军医大学实验动物中心）。随机分为3组,即BLM组、肺炎链球菌组、正常组,每组15只。BLM组用博莱霉素-A5的溶液（天津太河制药有限公司出品,8 mg/支,批号040902）用生理盐水配成4 g/L溶液,按5 mg/kg给药注入气管。注入过程中将大鼠直立、旋转,使药液在肺内分布充分、均匀。肺炎组在相同条件下向气管内注入肺炎链球菌菌液0.15 mL/只（中国药品生物制品检定所出品,细菌号31003,复苏繁殖2代,稀释成菌液,菌落数3×108/mL）。正常组在相同条件下向气管内注入0.25 mL的生理盐水,方法同上。分别于给药后第3,7,14,21和28 d处死大鼠,经右室流出道用生理盐水冲洗致大鼠肺发白后,取肺组织用10 g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋、切片,HE、VG染色;取少量各组肺组织用3%的戊二醛固定后制作成电镜标本,观察PMVECs形态学改变。ELISA法检测各组血清CTGF含量及其时相变化趋势。免疫组织化学染色采用两步法检测观察对比各组大鼠肺间质中CTGF在PMVECs中的表达情况。结果:1、肺炎与BLM组光镜观察:肺炎组第3 d肺间质内见大量炎细胞,肺泡腔结构消失呈片状实变区,第14 d肺通气基本恢复正常;BLM组第3 d肺泡腔渗出性改变,肺泡间隔炎细胞浸润,第14 d、21 d肺泡间隔增厚明显,实变区明显增多,间质Fb增多,第28 d肺泡间隔增厚,可见大量胶原纤维。2、PMVECs超微结构观察:肺炎组第7 d PMVECs呈增生状态,紧密连接开放,胞质厚度增加,吞饮小泡明显减少,之后恢复正常;BLM组PMVECs表面不光整,表面可见指状突起及血小板粘附,体积增大呈增生状态,第7、14、21 d细胞内吞饮小泡明显持续增多,且紧密连接持续开放,第28 d PMVECs旁大量胶原沉积。3、血清CTGF测定:肺炎组第3 d增高,第7 d骤降,之后恢复正常（12.06±0.43pg/mL）;BLM组第7 d开始增高,第21 d增至高峰（19.45±0.41pg/mL）,组间差异明显（n=15, p<0.05）,两组比较差异具有统计学意义。4、免疫组化染色:BLM组第21 d大鼠肺组织CTGF阳性表达较肺炎组第21 d明显增高,肺间质MVECs的CTGF阳性表达明显（n=15,p<0.05）,两组比较差异具有统计学意义。结论:1、BLM可致大鼠PMVECs形态改变及功能紊乱,PMVECs表型转变是CTGF时相和量异常表达的关键因素之一,它可能是BLM所致PF发生发展的重要环节。2、基于PMVECs由“屏障表型”转变为“收缩”表型与EC代谢密切相关,[Ca2+]i代谢调节功能紊乱可能是EC表型转变及EC异常分泌CTGF的原因之一。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 肺脏的细微结构
• 2 PF的概述
• 3 PF的发生机制研究进展
• 4 肺微血管内皮系统与纤维化
• 正文
• 博莱霉素大鼠CTGF研究现状与PF发生的关系
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 个人简历
• 研究成果
• 致谢