论文摘要
研究背景癫痫（epilepsy）是最常见的神经系统疾病之一,患病率为5‰～7‰,全球约有3500万,我国约650万患者正在遭受该疾病的困扰。而癫痫持续状态（statusepilepticus,SE）是癫痫的严重状态,是指持续性痫性发作超过30分钟,或者两次或两次以上的相继的痫性发作,期间意识状态未能完全恢复正常。SE可造成海马等结构的神经元选择性死亡,这种选择性神经元死亡能促进癫痫的形成和进展,因此,有关癫痫病人的神经保护治疗日益成为人们关注的热点。有充分的证据表明SE能引起明显的神经元损害,特别是在动物和人类的边缘系统,一般认为坏死是癫痫后大脑皮质细胞死亡的主要形式,但凋亡也在癫痫导致的脑损害中起重要的作用。钙蛋白酶（calcium-activated non-lysosomal protease,calpain）是Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白酶,广泛存在于神经细胞内。calpain有两种组织非特异性形式μ-calpain（calpain-1）和m-calpain（calpain-2）。μ-calpain广泛存在于神经元细胞,而m-calpain主要分布于抑制性中间神经元和星形细胞,两种形式都通过内源性抑制剂-钙蛋白酶抑素（calpastatin）调节。胞浆高浓度游离Ca2+触发calpain的激活,可水解细胞骨架蛋白、激酶和磷酸酶、一些信号转导蛋白和转录因子等,最终导致细胞死亡。Calpain介入神经元死亡见于多种神经性疾病如脑缺血,脊髓损伤和阿尔茨海默病等。一般认为calpain的激活与神经元坏死的发生有直接关系,而最近的研究显示,Calpain也可引起神经元程序性死亡（programmed cell death,PCD）。Calpain的激活与PCD有关首先在胸腺细胞中发现,随后在多种病因引起的细胞PCD中都发现与calpain的激活有关。大鼠局灶性脑缺血及全脑短暂缺血再灌注模型,海马CA1区出现calpain广泛激活,神经元发生形态改变、DNA片段化及PCD,特异性calpain抑制剂可抑制细胞PCD的发生,有力地证明calpain的激活参与了细胞的PCD过程。Calpain是否参与了SE后神经细胞PCD过程及PCD的机制如何等目前研究结果不一,其中在calpastatin基因敲除的突变鼠红藻氨酸（kainic acid,KA）兴奋毒性致海马神经损伤中,Bid激活,凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）、核酸内切酶G胞核转位,DNA降解及核浓缩等,提示calpain在致DNA断裂的兴奋毒性信号转导级联中发挥重要的作用,但考虑到KA海马注射的野生型鼠与calpastatin过表达鼠的研究结果相似,因此很有必要在calpain及calpastatin“正常”水平的大鼠中研究calpain参与SE后神经元PCD的机制。本研究通过建立氯化锂-匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫持续状态（lithium chloridepilocarpine-inducedstatus epilepticus,LPSE）模型,检测SE后海马神经元损伤的病理特征,PCD状况,μ-calpain和部分相关凋亡分子的活性。应用μ-calpain抑制剂MDL-28170进行干预,检测μ-calpain介导的PCD相关蛋白、基因表达变化和信号通路以及其对SE后海马神经元的保护作用。本研究共分三部分进行。第一部分氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态大鼠海马损伤和神经元程序性死亡目的研究LPSE模型大鼠行为学、电生理及病理学改变,进一步探讨癫痫发作造成的海马神经元损伤,观察癫痫后神经元PCD的存在。方法1.成年雄性Wistar大鼠,分为对照组、致痫后6h、12h、1d、3d、5d和7d组,腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠出现SE,SE持续2h后注射地西泮终止发作。2.于致痫前、后对大鼠进行EEG描记。3.将大鼠在各时间点多聚甲醛灌注取脑,用HE（haematoxylin & eosin）和Nissl染色观察大鼠海马病理学改变。4.应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotin nick-end-labeling,TUNEL）观察海马神经元程序性死亡改变。结果1.氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠SE诱发率为91.7%;EEG在急性期表现为丛集性棘波放电,潜伏期EEG正常。2.HE及Nissl染色示正常大鼠海马神经元结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。于SE后6h-7d均可观察到大鼠海马神经元损伤,表现为神经元肿胀、破裂,排列紊乱,胞浆尼氏小体减少,存活神经元数目较对照组减少（P＜0.05）。3.SE后6h大鼠海马就可见少量TUNEL标记细胞,3d时TUNEL阳性神经元显著增多,持续到7d。各组TUNEL标记细胞数均比对照组明显增多（P＜0.05）,3d、5d及7d大鼠与6h、12h及1d组亦有显著差异（P＜0.05）。结论1.依致痫后大鼠行为学及EEG改变氯化锂-匹罗卡品成功诱发大鼠SE模型。2.LPSE可造成大鼠海马神经元损伤。3.LPSE可致大鼠海马神经元程序性死亡。第二部分μ-calpain介入氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态大鼠海马神经元程序性死亡的研究目的研究μ-calpain参与LPSE大鼠海马神经元PCD的过程及其抑制剂的保护作用。方法1.成年雄性Wistar大鼠,分正常对照及致痫后6h、12h、1d、3d、5d和7d组,腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠出现SE,SE持续2h后注射地西泮终止发作。研究μ-calpain抑制剂MDL-28170时选择致痫后3d大鼠分为匹鲁卡品组,匹鲁卡品+生理盐水组,匹鲁卡品+MDL-28170组以及正常对照组。2.大鼠分别在各时间点多聚甲醛灌注取脑,应用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）方法观察μ-calpain及caspase-3的活性表达变化及MDL-28170对其表达的影响。3.于各时间点大鼠断头取脑,快速冰上取海马,提取海马组织蛋白,应用免疫印迹（Western blotting）方法检测海马μ-calpain、caspase-3和α-Ⅱ-血影蛋白（α-Ⅱ-spectrin,αⅡSp）的表达以及MDL-28170对其表达的影响。4.应用Nissl染色观察MDL-28170对SE后大鼠海马神经元损伤的影响。5.应用TUNEL方法研究MDL-28170对海马神经元程序性死亡的影响。结果1.μ-calpain在LPSE后6h后即激活,3d达高峰,而caspase-3在致痫后1d开始激活,5-7 d达高峰。β-calpain特异性145kD-αⅡSp片段及caspse-3特异性120kD-αⅡSp片段的表达与β-calpain和caspase-3活性表达相似。2.μ-calpain抑制剂MDL-28170能减少LPSE后海马神经元的损伤,MDL组存活神经元的数目较匹鲁卡品组,匹鲁卡品+生理盐水组明显增多（P＜0.05）。3.μ-calpain抑制剂MDL-28170能减少LPSE后海马神经元PCD的程度,较匹鲁卡品组,匹鲁卡品+生理盐水组凋亡细胞数目减少（P＜0.05）。4.μ-calpain抑制剂MDL-28170能减弱LPSE后μ-calpain及其特异性145kD-αⅡSp片段的表达,但对caspse-3及其特异性120kD-αⅡSp片段的表达没有影响。结论1.μ-calpain及caspase-3均参与LPSE大鼠海马神经元PCD损伤过程,μ-calpain介入PCD的早期过程,而caspase-3则介入晚期过程。2.μ-calpain抑制剂MDL-28170通过抑制μ-calpain的表达对LPSE大鼠海马神经元起保护作用,并能减轻PCD的程度。第三部分μ-calpain介入氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态大鼠海马神经元程序性死亡信号通路的研究目的研究μ-calpain介入LPSE大鼠海马神经元PCD的细胞信号通路。方法1.成年雄性Wistar大鼠,腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠出现SE,持续2h后注射地西泮终止发作。选取对照组、致痫后6h、12h、1d、3d、5d和7d组应用Western blotting方法分析相关蛋白的表达及动态变化;选取致痫后3d大鼠分为对照组,匹鲁卡品组,匹鲁卡品+生理盐水组、匹鲁卡品+MDL-28170组、匹罗卡品+ZVF组观测各抑制剂对相关蛋白和基因的表达影响。MDL-28170为μ-calpain选择性抑制剂（致痫前后腹腔注射）,ZVF即Z-VAD（OMe）-fmk为caspases广谱抑制剂（致痫前后脑室注射）。2.将各组大鼠断头取脑,海马-80℃存储待用。3.应用Western blotting方法检测对照组及LPSE后大鼠Bid蛋白的表达,AIF及细胞色素C蛋白不同亚细胞组分的表达变化。4.应用逆转录PCR技术（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）方法检测对照组及LPSE后3d大鼠海马μ-calpain、caspase-3、caspase-8和caspase-9、Bid及AIF mRNA水平表达及MDL-28170和ZVF对其表达的影响。5.应用Western blotting方法检测对照组及LPSE后3d大鼠海马Bid、AIF、和细胞色素C蛋白的表达,以及MDL-28170及ZVF对其表达的影响。结果1.大鼠海马在LPSE后12h、1d、3d、5d及7d蛋白tBid的表达、AIF的核转位及细胞色素C的释放较对照组有显著差异（P＜0.05）,但tBid表达、AIF的核转位及细胞色素C从线粒体释放在SE后3d最明显,此后逐渐减弱,但仍较对照组明显（P＜0.05）。2.LPSE后3d大鼠海马神经元μ-calpain、Bid、AIF mRNA水平上调（P＜0.05）,但caspase-3、caspase-8及caspase-9 mRNA水平轻度上调,与对照组比较仍有差异（P＜0.05）。MDL-28170能抑制μ-calpain、Bid及AIF mRNA表达水平（P＜0.05）,而对caspase-3、caspase-8及caspase-9未有影响（P＞0.05）。ZVF则对μ-calpainmRNA水平表达未有明显影响（P＞0.05）,可减弱caspase-3、caspase-8及caspase-9的mRNA表达（P＜0.05）（图2A,B）,能轻度减弱Bid及AIF的表达,但与匹罗卡品+生理盐水组、匹罗卡品组比较无统计学意义（P＞0.05）。3.MDL-28170能减弱LPSE后3d大鼠海马tBid蛋白表达水平及AIF的核转位和细胞色素C的线粒体释放（P＜0.05）,而ZVF则对其影响不大（P＞0.05）。结论μ-calpain通过非caspases依赖途径介导LPSE致大鼠海马神经元PCD过程,包括Bid转为tBid,AIF从线粒体转位细胞核及细胞色素C从线粒体释放到胞浆。研究意义本研究应用大鼠氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型,证实了癫痫发作后海马神经元损伤、程序性死亡的存在及μ-calpain、caspase-3参与的不同过程,阐明了μ-calpain通过调节Bid,AIF等线粒体途径介导神经元程序性死亡的机制,证实了μ-calpain抑制剂的神经保护作用。尽管μ-calpain抑制剂未能抑制癫痫发作的程度,但对μ-calpain在癫痫中作用的相关研究将有助于了解癫痫致神经元损伤的机制,并有助于寻找新的药物作用靶点,研发新的神经保护药物。
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