论文摘要
研究目的本课题涉及一种新的功能性基因-HMBOX1的研究。HMBOX1属于Homeobox家族成员,其蛋白N端带有homeobox结构域,C端带有DNA结合结构域。到目前为止,HMBOX1已发现两种异构体,HMBOX1和HMBOX1b（缺失Homeobox结构域）。HMBOX1基因在不同种属中具有高度保守性,在人类可表达于18种组织中,其中在胰腺、脑、肝脏、肾脏等组织中高表达,既可表达在细胞浆,也可表达于细胞核。HMBOX1是一种潜在的转录抑制因子,本实验室前期研究中发现HMBOX1基因对自然杀伤细胞具有明显的调控作用。对HMBOX1具体功能的研究,不仅可以揭示这个新基因的功能,而且可以为进一步了解NK细胞发育和功能调节过程奠定基础。新型转录因子的研究,特别是转录因子调控和相互作用的研究离不开高特异性的抗体。本研究拟通过原核表达系统表达HMBOX1重组蛋白并制备其单克隆抗体,然后利用高特异性抗体研究HMBOX1的特征和功能。1.首先构建HMBOX1原核表达载体,然后通过原核表达系统获得重组融合蛋白。2.原核蛋白常以包涵体形式存在,所以对重组蛋白进行了纯化和复性条件优化。3.以具有天然构象的重组蛋白为抗原,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体。4.确定单克隆抗体的特征并验证单抗的特异性。5.鉴定单克隆抗体的应用范围。6.应用制备的单抗研究HMBOX1在人体组织中的表达并初步研究其功能。研究方法1.PCR及RT-PCR构建原核重组表达载体pET22b-HMBOX 1-6His。2.原核表达载体的诱导表达。1mM IPTG,37℃4h诱导E. coli Rosetta （DE3）菌株中HMBOX1重组蛋白的表达。3.Ni2+亲和层析纯化和复性重组HMBOX1蛋白利用重组蛋白6His标签蛋白,Ni2+亲和层析纯化蛋白,并通过梯度稀释的尿素复性结合在固相凝胶上包涵体蛋白。4.制备酸处理裸菌以鼠伤寒杆菌为基础经稀醋酸处理得到裸菌,作为免疫佐剂。5.免疫接种动物和杂交瘤技术制备单克隆抗体。6.注射腹水大量制备单克隆抗体。7. ELISA和竞争性ELISA鉴定抗体的效价和亲和力。8. SDS-PAG鉴定重组蛋白的表达。9.免疫标记技术检测组织和细胞中HMBOX1的表达。通过Western blot免疫印迹技术、免疫组化技术（细胞爬片,组织芯片）检测细胞和组织中HMBOX1的表达情况；通过免疫荧光技术结合显微镜检测HMBOX1的细胞定位；免疫荧光结合流式细胞仪检测HMBOX1的胞内表达。10.免疫共沉淀技术检测单克隆抗体的应用并检测肝细胞系中HMBOX1的表达。研究结果1.重组HMBOX1蛋白的表达、纯化和复性1.1原核重组表达载体pET22b-HMBOX1-6His的构建首先,通过RT-PCR制备人自然杀伤细胞系NK-92细胞cDNA,利用HMBOX1特异性引物和高保真Ex Taq酶扩增得到人HMBOX1基因的蛋白编码序列,通过测序验证基因序列。然后以此为模板,重新设计引物得到改造的PCR扩增产物；PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与载体pET22b连接,构建得到表达产物C端带有信号肽引导序列和6×His标签蛋白的pET22b-HMBOX1表达载体。1.2重组蛋白的表达、纯化和复性将构建的原核表达载体转入E. coli Rosetta （DE3）菌株,此菌株能够表达含有大量稀有碱基的人体蛋白。实验表明,通过1mM IPTG诱导表达的重组蛋白以不可溶的包涵体形式存在。为获得具备天然构象的HMBOX1,重组蛋白经镍亲和层析技术同步纯化和复性,复性采用浓度梯度降低的尿素灌流液流经亲和柱,使吸附在固相载体上的蛋白重新折叠,最后收集重新折叠的重组HMBOX1蛋白。然后质谱技术进行蛋白测序,验证了复性HMBOX1蛋白的序列正确性。另外,非变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳证实,重组蛋白具备了天然构象并可形成二聚体,说明重组蛋白可能具有HMBOX1的天然构象。2. HMBOX1单克隆抗体的制备2.1单克隆抗体的制备以酸处理的鼠伤寒杆菌裸菌作为佐剂与复性重组HMBOX1蛋白一起免疫接种小鼠。蛋白质抗原可以吸附在酸处理裸菌上,表明可增强其诱导免疫应答的能力。当抗体效价达到一定程度时,应用杂交瘤技术,获得两株HMBOX1单克隆抗体杂交瘤细胞：2A5F4和4A4F2。2.2单克隆抗体的特征及应用研究免疫球蛋白类型鉴定证明：2A5F4株单抗为IgG2b/K类型,4A4F2株单抗为IgM/κ类型。ELISA和竞争性ELISA试验表明：纯化的2A5F4株单抗的效价和亲和力分别为1.024×10-5和3.67×108M-1；纯化的4A4F2株单抗的效价和亲和力分别为5×10-5和3.35×108M-1。这两株抗体具备较高的灵敏度并能特异性地和原核蛋白以及天然构象真核蛋白结合。经免疫印迹和免疫组化分析验证,4A4F2株抗体能检测到HMBOX1在HEK-293T细胞中的表达变化,即在转染pcDNA3.1-HMBOX1的细胞中HMBOX1表达增加,在转染siRNA/HMBOX1的细胞中HMBOX1表达降低。而2A5F4株单抗仅能应用于免疫组化技术的检测。因此,这两株单抗可与具有天然构象的真核蛋白发生特异性结合并能应用于免疫印迹和免疫组化的检测分析。另外,制备的单克隆抗体可应用于流式细胞术胞内检测和免疫共沉淀等多种免疫分析技术,为HMBOX1的体外作用机制研究提供了可靠的技术支持。尤其是2A5F4和4A4F2分别作为共沉淀抗体和免疫印迹抗体可以对肝脏细胞中的HMBOX1进行免疫共沉淀分析,为进一步HMBOX1的靶基因研究和蛋白质相互作用研究提供了技术保障。3.人体组织中HMBOX1表达谱研究及肿瘤表达差异性研究3.1细胞内HMBOX1蛋白的定位和组织分布利用制备的高特异性单克隆抗体,通过免疫荧光技术研究HEK-293T细胞中HMBOX1的表达,发现HMBOX1蛋白同时表达于细胞浆和细胞核,这也表明HMBOX1发挥生理作用的可能机制为从细胞浆转位到细胞核。以人体组织石蜡切片和组织芯片为研究对象,发现HMBOX1在多种人体组织中表达,特别在肾脏,大脑,甲状腺,胃,肠,肝,胰腺,肺,心脏肌肉,睾丸和前列腺等组织表达量较高。3.2 HMBOX1在人体正常组织和肿瘤组织中表达谱的差异HMBOX1可在多类型肿瘤组织中表达。与癌旁组织相比,在一些肿瘤中存在差异表达。肝癌组织中的HMBOX1蛋白水平比癌旁组织显著性的减少；肾脏组织中的HMBOX1主要表达在肾小管,而在肾小球中表达很低,特别在肾小管来源的肾透明细胞癌肿高度表达；胰腺组织和肿瘤中都可见HMBOX1的高度表达,但未发现明显差异。HMBOX1在肝癌细胞中表达,这为进一步研究HMBOX1在肝癌的发生、发展过程中的作用提供了细胞研究模型。研究结论1.成功构建了重组人HMBOX1原核表达载体pET22b-HMBOX 1-6His。2.在E. coli Rosetta （DE3）诱导表达了重组HMBOX1蛋白,并利用His亲和层析的方法对HMBOX1包涵体蛋白成功的进行了复性。复性蛋白具有HMBOX1的天然构象。3.制备了两株特异性HMBOX1单克隆抗体：2A5F4和4A4F2。4.两株单抗可特异性识别真核构象HMBOX1,并应用于、vestern blot和免疫组化检测。5. HMBOX1既可以表达在细胞浆也可以表达于细胞核。6. HMBOX1在多种组织中高表达,如肝脏、肾脏、胰腺和脑组织。7. HMBOX1在多种肿瘤组织中存在差异表达,特别是正常肝脏组织中的表达显著高于肝癌组织中的表达。8.肝细胞系HMBOX1的表达研究为阐明肝脏和肝癌中HMBOX1的功能提供了技术支持。研究意义本课题建立了一种HMBOX1原核蛋白表达、纯化和复性的有效方案,并在此基础上制备获得两株高特异性单克隆抗体。这两株单克隆抗体可用于多种免疫检测分析,为进一步研究HMBOX1的功能奠定了基础。另外,HMBOX1作为一种转录因子,可能参与了肿瘤发生的具体机制,并可能对糖物质代谢具有调控作用。所以,HMBOX1的功能和作用机制有待于本课题组进行深入研究。
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相关论文文献
- [1].前列腺癌中HMBOX1的表达水平及其对细胞上皮间质化的影响[J]. 中国现代医学杂志 2020(01)
- [2].miR-195-5p靶向HMBOX1调控胃癌细胞增殖迁移侵袭及凋亡的机制[J]. 中国老年学杂志 2020(15)
- [3].核转录因子HMBOX1对肝癌细胞生物学特征的影响[J]. 中国免疫学杂志 2012(07)