论文摘要
第一部分蛋白质转导结构域（protein transduction domain,PTD）是一类具有跨膜活性的、富含碱性氨基酸残基的肽段。PTDs作为载体能够携带外源大分子进入细胞和活体动物组织。因此,无论在基础分子生物学研究领域,还是在发展新型、高效、特异性强的治疗性药物及疫苗研究领域,PTDs都具有引人瞩目的应用前景。Pax4是胰腺早期分化及成熟胰岛细胞增殖过程中起重要作用的转录因子。Pax蛋白质的DNA结合域由Paired结构域和Homeo-like结构域构成。本研究发现Pax4蛋白质能够进入人胚肺细胞系HELF细胞中。我们进而对Pax4蛋白质转导结构域进行了分析,根据已知Pax4蛋白质结构信息,构建、表达并纯化了一系列Pax4突变体与EGFP的融合蛋白质,进胞实验结果显示完整的Paired Domain是Pax4的蛋白质转导结构域。Paired-EGFP融合蛋白质可以高效进入包括大鼠胰岛细胞在内的多种细胞。Pax家族蛋白的Paired Domain具有保守性,Pax5和Pax6的Paired融合蛋白质也具有转导能力。在进胞机制的研究中,我们发现Paired PTD首先黏附于细胞膜表面,而后主要通过巨胞饮作用进入细胞。EMSA及荧光素酶报告基因实验结果显示跨膜后的Pax4蛋白质仍然可以行使转录因子功能,即与其特异性结合序列结合,竞争性地抑制Pax6的转录激活作用。将外源纯化的Pax4蛋白质加入Min6细胞,它能够保护细胞免于TNFα引发的凋亡。转导进入大鼠胰岛细胞的Pax4蛋白质通过促进bcl-xL和c-myc基因表达,增加细胞存活率,延长胰岛细胞的体外培养时间。本研究首次提出Pax家族蛋白具有蛋白质转导功能,揭示了Paired PTD的跨膜转导机制,发现外源纯化的Pax4蛋白质转导入细胞后依然具有与内源Pax4转录因子相似的生物学功能,能够抑制大鼠胰岛细胞凋亡,为今后胰岛细胞移植治疗提供了新的思路。第二部分胰腺发育相关转录因子决定胰腺早期细胞的分化命运。成熟胰腺中,PDX-1、NeuroD、Nkx6.1、Pax4、MafA等转录因子通过调控维持β细胞表型的关键基因,特别是胰岛素基因的表达,从而有利于实现机体的葡萄糖平衡。研究发现病毒转染的非胰岛细胞过量表达这些转录因子,能够刺激细胞表达分泌胰岛素。但是由于病毒载体在实际应用中存在潜在风险,而蛋白质转导肽能够携带多种分子进入细胞,因此蛋白质转导系统可能成为一种携带转录因子的新的、更安全的方式。碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子MafA,特异性地在β细胞中表达,它不仅参与胰岛素基因的转录调节,还调控着多个维持β细胞功能的基因的转录表达。本研究发现MafA具有蛋白质转导功能,能够进入HEK293细胞。其DNA结合域的Basic序列富含碱性氨基酸,是MafA的转导结构域。Basic PTD可以高效介导与之融合的EGFP蛋白质进入各种细胞系（HEK293、IEC6、PLC/PRF/5）。在进胞机制的研究中,细胞膜黏附和巨胞饮抑制剂不同程度地抑制MafAb-EGFP融合蛋白质的进细胞效率,说明Basic PTD首先黏附于细胞膜表面,而后主要通过巨胞饮作用进入细胞,与第一部分Paired PTD机制相似。跨膜后的MafA蛋白质仍然可以行使转录因子功能。荧光素酶报告基因实验结果显示,MafA蛋白质在进入细胞后可启动大鼠insulin 2基因启动子,促进报告基因转录表达。MafA蛋白质转导入大鼠小肠上皮细胞系IEC6细胞,能够促进其insulin 2基因转录。利用细胞免疫荧光技术我们还检测到MafA实验组细胞表达胰岛素。糖尿病小鼠血糖在尾静脉注射MafA蛋白质24h时降至正常水平。RT-PCR,Real-time荧光定量PCR实验结果表明,MafA能够诱导小肠组织胰岛素基因转录增加,与对照组相比insulin1和insulin2基因的转录水平分别提高4.1及9.8倍。组织免疫荧光结果显示注射MafA蛋白质后小肠绒毛间的上皮细胞中存在有胰岛素阳性细胞。本研究首次发现转录因子MafA具有蛋白质转导功能,阐明了Basic PTD的跨膜转导机制。外源纯化的MafA蛋白质在体外和体内实验中都能诱导小肠细胞表达胰岛素,对糖尿病小鼠有一定的治疗作用。该研究为1型糖尿病治疗提供了“MafA蛋白质治疗”的新思路。
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标签：蛋白质转导结构域论文; 糖尿病论文; 胰岛细胞论文; 序列论文; 小肠组织论文;