论文摘要
动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病,免疫调节起着至关重要的作用。CD40与CD40配体（CD40L,CD154）是一对互补跨膜糖蛋白,分别属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）和TNF超家族成员,是体液免疫和细胞免疫的一条重要的细胞信号转导途径,在抗原提呈和自身免疫性疾病中起重要作用。CD40L在体内主要以2种形式存在,即与相应细胞膜结合的膜结合型CD40L（membrane-bound CD40L,mCD40L）和游离状态的可溶性CD40L（soluble CD40L,sCD40L）。近年来的研究表明CD40-CD40L系统参与了动脉粥样硬化（artherosclerosis,AS）的起始、发展和斑块破溃后急性并发症。在动脉粥样硬化斑块中的上皮细胞、单核—巨噬细胞和平滑肌细胞上均有CD40和CD40L表达,而在正常动脉组织中没有或低表达。CD40L与CD40链接能诱导人类血管内皮细胞表达黏附分子,如E-选择素、血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule,VCAM）-1和细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule,ICAM）-1,并刺激释放趋化因子和细胞因子,如白细胞介素（interleukin,IL）-8、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（regulated upon Activation Normal T-cell Expressed andSecreted,RANTES）或巨噬细胞炎性蛋白1a,这些分子参与了动脉粥样硬化斑块的形成。应用特异性抗CD40L抗体阻断CD40-CD40L之间的相互作用可明显抑制AS斑块的形成,并使病灶内成分改善,稳定性增加,巨噬细胞和脂质减少,平滑肌和胶原纤维增加。因此,CD40-CD40L系统不但参与动脉粥样硬化斑块的形成,更重要的是可能参与使斑块不稳定、破溃,导致血栓形成。目前CD40-CD40L系统与急性冠脉综合征的关系研究已成为热点,动脉粥样硬化是脑梗死的基本病因,但该系统在急性脑梗死中的作用研究尚少,本研究着重观察不同病因类型脑梗死、单纯颈动脉狭窄及正常对照组周围血单核细胞CD40L表达和血清sCD40L水平,分析人颈动脉粥样硬化斑块中CD40表达与临床卒中事件的关系,研究CD40-CD40L系统在急性脑梗死中的临床意义及对动脉粥样硬化斑块稳定性的作用。通过观察颈动脉粥样硬化斑块中CD40、CD40L与MMP9的关系,探讨CD40-CD40L系统影响斑块稳定性的机制。期望找到判断斑块稳定性、脑梗死病因和严重程度的简便生物学指标,并为治疗和预防动脉粥样硬化和脑梗死找到新的干预靶点。第一部分急性脑梗死患者周围血单核细胞CD40L表达和血清sCD40L的临床意义目的观察不同病因类型急性脑梗死患者周围血单核细胞CD40L表达和血清sCD40L水平的变化,探讨其在诊断大动脉粥样硬化型脑梗死和判断脑梗死病情中的价值,研究其对脑动脉粥样硬化及其斑块稳定性的作用。方法入选我院神经内科的急性脑梗死患者82例,按SSS-TOAST分型分为大动脉粥样硬化型脑梗死组30例、小动脉闭塞型脑梗死组36例和心主动脉栓塞型脑梗死组16例,收集有颈动脉粥样硬化狭窄而无缺血性卒中事件患者17例为单纯颈动脉狭窄组,另设正常对照组20例。对急性脑梗死患者进行NIHSS评分、Barthel指数、改良Rankin评分,分别从神经功能、日常生活活动能力和残疾状况对患者病情进行全方面评估。采用直接免疫荧光流式细胞术检测各组周围血单核细胞CD40L表达,ELISA检测血清sCD40L水平,全自动生化仪以免疫散射比浊法检测各组血清hs-CRP水平。结果1.大动脉粥样硬化脑梗死组血清hs-CRP水平高于单纯颈动脉狭窄组（P＜0.05）。2.周围血单核细胞CD40L表达,动脉粥样硬化患者高于无动脉粥样硬化患者（P＜0.01）,其诊断动脉粥样硬化的敏感性和特异性高于血清hs-CRP（P＜0.01）;大动脉粥样硬化型脑梗死组高于单纯颈动脉狭窄组（P＜0.01）,其判断斑块稳定性的敏感性和特异性高于血清hs-CRP（P＜0.01）;大动脉粥样硬化型脑梗死高于其他类型脑梗死（P＜0.01）,其诊断大动脉粥样硬化型脑梗死的敏感性高于血清hs-CRP（P＜0.01）,两者的特异性无显著性差异（P＞0.05）。3.血清sCD40L水平与NIHSS评分有正相关关系（r=0.537,P＜0.01）,相关性高于hs-CRP（r=0.432,P＜0.01）;sCD40L水平与Barthel指数有负相关关系（r=-0.515,P＜0.01）,相关性高于hs-CRP（r=-0.510,P＜0.01）;sCD40L与改良Rankin评分有正相关关系（r=0.589,P＜0.01）,相关性高于hs-CRP（r=0.482,P＜0.01）。结论血清hs-CRP水平与脑动脉粥样硬化斑块稳定性相关;周围血单核细胞CD40L表达与动脉粥样硬化、斑块稳定性和大动脉粥样硬化型脑梗死相关;单核细胞CD40L表达在判断动脉粥样硬化、斑块稳定性和诊断大动脉粥样硬化型脑梗死上比血清hs-CRP具有更高的敏感性和特异性;血清sCD40L水平与脑梗死病情的严重程度成正相关,与患者的日常生活活动能力成负相关,相关性高于血清hs-CRP,可作为反映脑梗死病情轻重的生物学指标。第二部分CD40在人颈动脉粥样硬化及斑块稳定性中的作用目的观察正常颈动脉和颈动脉粥样硬化斑块中CD40 mRNA水平和蛋白表达情况,分析其与临床卒中事件的关系,探讨其与动脉粥样硬化及斑块稳定性之间的关系。方法收集颈动脉粥样硬化狭窄（＞70%）行颈动脉内膜切除术的颈动脉粥样硬化斑块标本28例,根据患者有无发生急性缺血性脑卒中事件分为有临床卒中事件组和无临床卒中事件组,另收集尸检正常颈动脉标本8例作为对照组。Realtime PCR检测各组CD40 mRNA水平,Western blotting检测各组CD40蛋白表达情况。结果颈动脉粥样硬化斑块CD40 mRNA水平高于正常颈动脉（P＜0.01）,有临床卒中事件组CD40 mRNA水平高于无临床卒中事件组（P＜0.01）。正常颈动脉中CD40基本不表达,无卒中事件组CD40表达明显高于正常颈动脉,有卒中事件组又明显高于无卒中事件组。结论颈动脉粥样硬化斑块中CD40的转录和表达水平较正常颈动脉明显增高,有临床卒中事件的不稳定斑块增高更加显著,提示CD40参与了动脉粥样硬化的形成,并且与斑块稳定性相关。第三部分CD40-CD40L系统影响动脉粥样硬化及斑块稳定性的机制研究目的研究颈动脉粥样硬化斑块中CD40和MMP9mRNA水平及蛋白表达的关系,并观察CD40、CD40L和MMP9表达及分布关系,探讨CD40-CD40L系统影响动脉粥样硬化及斑块稳定性的可能机制。方法收集颈动脉粥样硬化狭窄（＞70%）行颈动脉内膜切除术患者的颈动脉粥样硬化斑块标本28例,根据患者有无发生急性缺血性脑卒中事件分为有临床卒中事件组和无临床卒中事件组,另收集尸检正常颈动脉标本8例作为对照组。RealtimePCR检测各组CD40和MMP9 mRNA水平,Western blotting检测各组CD40和MMP9蛋白表达情况。免疫组化检测各组CD40、CD40L和MMP9表达及分布。结果1.颈动脉粥样硬化斑块中CD40、MMP9mRNA水平高于正常颈动脉（P＜0.01）,且有临床卒中事件组CD40、MMP9 mRNA水平高于无临床卒中事件组（P＜0.01）;2.CD40 mRNA与MMP9mRNA有正相关关系（r=0.964,P＜0.01）;3.正常颈动脉中CD40和MMP9基本不表达,无卒中事件组CD40和MMP9的蛋白表达明显高于正常颈动脉,有卒中事件组又明显高于无卒中事件组;4.免疫组化显示CD40、CD40L主要表达于动脉粥样硬化斑块的内皮细胞和平滑肌细胞,MMP9主要位于胶原蛋白和平滑肌细胞上,CD40、CD40L和MMP9均在斑块肩部表达增多尤为明显,CD40、CD40L和MMP9表达有卒中事件组高于无临床卒中事件组（P＜0.01）,无卒中事件组高于正常颈动脉（P＜0.01）;5.CD40、CD40L与MMP9表达有正相关关系（P＜0.01）。结论CD40-CD40L系统可能通过上调MMP9导致动脉粥样硬化及斑块不稳定。综上所述,CD40-CD40L系统可以成为判断脑动脉粥样硬化、斑块稳定性、脑梗死病情轻重和诊断大动脉粥样硬化型脑梗死的敏感的生物学指标,CD40-CD40L系统可能通过上调MMP9导致动脉粥样硬化和斑块不稳定。进一步深入研究CD40-CD40L系统在动脉粥样硬化和斑块稳定性中的作用及相关机制,有望能为治疗和预防动脉粥样硬化和脑梗死找到干预的新靶点。