论文摘要
支气管哮喘是在一定遗传背景之上,由多种因素参与的慢性气道炎症疾病,发病率与死亡率呈逐年升高的趋势。白细胞介素-1 （IL-1）为体内作用较强的致炎症细胞因子之一,在哮喘病发生、发展过程中具有重要作用。白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）是天然的IL-1拮抗剂,能在受体水平拮抗IL-1的作用,研究证实,IL-1ra具有治疗和预防哮喘的作用。在哮喘发病过程中,IgE与其高亲和力受体的结合是触发肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒导致哮喘发病的关键因素之一。阻断IgE与其高亲和力受体的结合是治疗哮喘的有效靶点,具有极大的发展潜力。本研究将IL-1ra和Fcε的功能进行了整合,利用基因工程技术将IL-1ra和IgE分子恒定区构建成融合蛋白,形成具有双重功能活性的新型蛋白分子,一方面拮抗IL-1的生物学效应并延长IL-1ra半衰期,另一方面抑制IgE与其高亲和力受体结合,从而达到防治哮喘的目的。本研究首次构建了人源及鼠源Fcε与人IL-1ra融合基因,并在原核表达系统中实现了高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。采用分子筛和离子交换层析对表达产物进行了纯化,获得了较高纯度的重组IL-1ra-Fcε融合蛋白,并采用逐步降低变性剂浓度的方式对融合蛋白进行了复性。EL-4/CTLL-2细胞学活性研究显示此融合蛋白可拮抗IL-1生物学活性,较IL-1ra活性无显著性变化;RBL-2H3细胞活性分析显示融合蛋白可与其表面的FcεRI相结合,又可抑制IgE介导的RBL-2H3细胞凋亡。为了分析以基因治疗方式给药时,IL-1ra-Fcε融合分子对变应性哮喘的治疗作用,我们构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1ra-Fcε,将其转染293T细胞,并经气管滴注方式滴入大鼠肺部。结果表明,融合基因IL-1ra-Fcε在转染后的293T细胞及大鼠肺组织中均得到表达。为了评价IL-1ra-Fcε融合分子对变应性哮喘的治疗作用,我们建立了大鼠变应性哮喘模型,通过蛋白静脉给药及基因治疗的方式分析了IL-1ra-Fcε对哮喘的治疗情况。通过对大鼠生理状态观测、肺功能测定、BALF中炎性细胞变化情况、血清中IgE及BALF中IL-4和IFN-γ含量测定、外周血中T细胞亚群变化、血管通透性以及肺组织病理变化等指标的检测,证实了IL-1ra-Fcε对变应性哮喘具有治疗作用,比较发现其治疗作用显著优于IL-1ra的治疗效果。免疫组化研究证实STAT6与哮喘发病严重程度相关。基因治疗的方式可能由于给药方式的原因,个体差异较大,但仍能显示对变应性哮喘具有一定的治疗效果。我们又对融合蛋白的治疗机制进行了初步分析。研究发现,在IgE诱导RBL-2H3细胞凋亡过程中仅对IgE信号途径中的关键信号分子Syk磷酸化水平产生了影响,而未影响IL-1信号途径中关键的信号分子IRAK1磷酸化水平,表明RBL-2H3细胞凋亡过程仅触发了IgE信号途径,而不能对IL-1信号途径产生影响;动物整体水平发现,单纯以IL-1ra为治疗药物即可同时触发IL-1信号途径及IgE信号通路;体内外实验均表明RBL-2H3细胞凋亡及哮喘发病过程中均可对NF-κB活性产生了影响,通过与IL-1ra治疗效果比较可以推断IL-1ra-Fcε融合蛋白的双功能活性均发挥了作用。所以我们认为炎性反应在变应性哮喘治疗中具有重要意义。初步药物代谢动力学分析结果表明IL-1ra-Fcε半衰期较IL-1ra得到了显著的延长,与预期结果相符。综上所述,1)构建了IL-1ra-Fcε融合基因,实现了在原核表达系统中的高效表达,经纯化、复性后,获得了较高活性的重组蛋白;2)构建了真核表达载体pIRES2- EGFP-IL-1ra-Fcε,分析了此载体对哮喘发病的预防作用;3)IL-1ra-Fcε对变应性哮喘具有较好的治疗作用,效果优于IL-1ra;4)验证了IL-1信号通路及IgE与受体作用信号通路在变应性哮喘中的作用,证实了炎性反应在哮喘发病机理中起主要作用;5)IL-1ra-Fcε融合蛋白分子半衰期较IL-1ra显著延长。总之,我们的研究为进一步揭示哮喘发病机理,并为变应性疾病治疗提供可能的理论依据和治疗途径。